31 января 2016г.
Согласно литературным данным [8,9,10,11], рилин и BDNF, синтезируемые в коре головного мозга, заметно влияют на структуру последней. Рилин - это гликопротеин, в пренатальном онтогенезе отвечающий за миграцию нейронов и точное их месторасположение, а постнатально - активно участвующий в органогенезе головного мозга посредством регулирования роста аксонов и дендритов, синаптогенеза и нейропередачи. BDNF - нейротрофный фактор мозга, поддерживающий рост и выживание мотонейронов. Вероятно, взаимодействие указанных факторов является одним из условий адекватного функционирования ЦНС плода в пренатальном онтогенезе. Как показали ранее выполненные исследования [2,3,5,6], внутриутробно формирующаяся патология вентрикулярной системы – вентрикуломегалия и внутренняя гидроцефалия – сопровождаются структурными изменениями не только вентрикулярной герминативной зоны, но и неокортекса. Исходя из функциональной значимости рилина и BDNF, считаем, что исследование особенностей их синтеза с учетом структурных изменений в коре, выявленных при патологии вентрикулярной системы [7], позволило бы уточнить инициальные механизмы врожденной гидроцефалии.
Поэтому целью настоящего исследования стало изучение особенностей экспрессии рилина и BDNF в коре головного мозга у плодов и новорожденных с различной степенью дилатации вентрикулярной системы - при вентрикуломегалии и врожденной гидроцефалии.
Головной мозг 50 плодов и новорожденных 22-40 недель гестации, полученных при различных способах родоразрешения женщин, распределили на три группы в зависимости от размеров боковых желудочков (БЖ). В первую из них вошли объекты головного мозга с вентрикуломегалией (19), предполагающей умеренную дилатацию задних рогов и тел БЖ от 0,6 до 1,0 см без увеличения размеров головы и истончения мозговой паренхимы. Вторая группа объединила образцы головного мозга с врожденной гидроцефалией - равномерно выраженной дилатацией всех отделов БЖ более 1,0 см, сопровождающейся увеличением размеров головы и истончением мозговой паренхимы (11). Группу сравнения составил головной мозг плодов с щелевидным просветом всех отделов БЖ, не превышающем 0,5 см (20).
Кусочки неокортекса размерами 0,5х0,5 см, иссеченные в передней трети прецентральной извилины (корковое представительство двигательного анализатора), в течение двух недель фиксировали в забуференном 10% формалине; микрообъекты для иммуногистохимического исследования подготавливали авидин-биотин- пероксидазным методом с применением поликлональных антител к рилину и BDNF («Dako», Дания), для окрашивания ядер использовали гематоксилин. Визуализацию образцов осуществляли с помощью светового микроскопа Micros Austria, исследуя по 100 клеток в 10 полях зрения при увеличении х 400. Интенсивность иммуногистохимического окрашивания позитивных клеток оценивали в баллах (от 0 до 3) с последующим вычислением индекса экспрессии (ИЭ) путем сложения показателей интенсивности окраски клеток в баллах (i), умноженных на процент позитивных P(i), с последующим делением результата на 100. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программного обеспечения «Statistica» [1].
Согласно собственным исследованиям, в неокортексе плодов и новорожденных группы сравнения иммунопозитивная реакция с антителами к рилину была выявлена в клетках Кахаля-Ретциуса и нейропиле молекулярного (I) слоя во все сроки гестации, в то время как иммунореактивность нейронов наружного зернистого слоя (II) впервые обнаруживалась в 38-40 недель (84%; ИЭ = 2,52 усл.ед.). Иммуногистохимическое окрашивание указанных структур было достаточно выраженным (3 балла), а доля рилин-содержащих клеток в молекулярном слое коры прогрессивно уменьшалась по мере увеличения гестационного возраста исследуемых плодов и новорожденных, в соответствии с чем значение ИЭ рилина было максимальным у плодов 22-27 недель гестации в клетках молекулярного слоя коры (Кахаля - Ретциуса) - 2,76 усл. ед., а в 38-40 недель – минимальным – 1,62 усл. ед. Подобная динамика показателя свидетельствует о наиболее интенсивном синтезе рилина именно в 22-27 недель гестации, что по срокам совпадает с завершением дифференцировки отдельных нейронов и неокортекса в целом, а также спуртом гирификации последнего [4].
Экспрессия BDNF в пирамидном слое неокортекса проявилась умеренным коричневым окрашиванием цитоплазмы нейронов (2 балла) и коррелировала с гестационным возрастом плодов. При этом минимальное значение индекса экспрессии - 1,8 усл. ед. - выявлено в 22-27 недель гестации, максимальное - 2,1 усл.ед. - при доношенной беременности в сроке 38-40 недель гестации, что указывает на завершение созревания пирамидных нейронов.
Исходя из полученных данных, предполагаем, что миграция нейробластов из вентрикулярной герминативной зоны в кортикальном направлении, дифференцировка слоев и гирификация неокортекса наиболее активно осуществляются в 22-27 недель гестации под контролем рилина. В последующие сроки пренатального онтогенеза темп указанных процессов замедляется, поскольку неокортекс практически сформирован. Появление рилин-позитивных клеток в наружном зернистом слое (II) неокортекса у доношенных новорожденных является свидетельством второй волны синтеза рилина структурами головного мозга, вероятно, необходимой для адекватного постнатального синаптогенеза, поскольку последний, как известно из литературных источников [9,10], контролируется именно рилином. Созревание нейронов моторной коры, контролируемое нейротрофным фактором, прогрессирует по мере увеличения гестационного возраста плода, достигая максимума к 38-40 неделям.
При вентрикуломегалии умеренно выраженную иммунореактивность к рилину (2 балла) проявляют 83% нейронов Кахаля-Ретциуса и нейропиль молекулярного (I) слоя – в 22-27 недель и 64% нейронов того же слоя – в 28-32 недели. При этом ИЭ рилина указанной локализации составляет 1,66 и 1,28 усл. ед., соответственно, что достоверно (p<0,05) меньше, чем в группе сравнения.
В сроки 33-37 недель иммунореактивность коры к рилину расценена как отрицательная, в связи с чем ИЭ гликопротеина не определялся.
У доношенных новорожденных (38-40 недель) вновь выявляется умеренное (2 балла) рилин-позитивное окрашивание клеток Кахаля-Ретциуса (81%) на фоне окрашивания нейропиля молекулярного слоя. При этом ИЭ рилина нейронами первого слоя, равный 1,62 усл.ед., достоверно-значимо не отличается от аналогичного параметра группы сравнения.
В эти же сроки впервые выявлена положительная иммунореактивность нейронов наружного зернистого слоя (43%), а ИЭ рилина составил 1,34 усл.ед., что достоверно меньше, чем в группе сравнения.
Понижение экспрессии рилина в молекулярном (I) слое с 22-й по 32-ю недели гестации с достоверно- меньшими значениями ИЭ, чем в группе сравнения, и отрицательная иммунореактивность с антителами к рилину с 33-й по 37-ю недели при вентрикуломегалии сочетаются с результатами ранее проведенных исследований [2,3] - замедлением дифференцировки неокортекса вплоть до 33-й недели гестации и запаздыванием гирификации больших полушарий головного мозга на 2-3 недели.
Считаем, что обнаруженные морфологические особенности неокортекса, указывающие на тканевую незрелость паренхимы головного мозга при вентрикуломегалии, взаимосвязаны с понижением синтеза рилина клетками Кахаля-Ретциуса. Однако экспрессия рилина нейронами II cлоя у доношенных новорожденных при вентрикуломегалии (ИЭ=1,34, что достоверно меньше, чем в группе сравнения, р<0,05) перспективна в плане продолжения незавершенной дифференцировки неокортекса в перинатальном периоде.
Экспрессия BDNF в нейронах пирамидного слоя неокортекса при вентрикуломегалии выразилась в интенсивном окрашивании цитоплазмы клеток (3 балла). Индекс экспрессии (максимальное значение - 2,7 усл.ед. в сроки 38-40 недель гестации) значимо (р˂0,05) превысил аналогичный параметр группы сравнения. Увеличение ИЭ при вентрикуломегалии, вероятно, обусловлено компенсаторным - в ответ на повреждение мозговой паренхимы - увеличением синтеза нейротрофина пирамидными нейронами моторной коры, который в свою очередь стимулирует незавершенные процессы созревания и миграции нейронов.
Выявленные особенности экспрессии рилина и BDNF в неокортексе при вентрикуломегалии в сочетании позволяют считать ВМ обратимым процессом и рассчитывать на продолжение дифференцировки и созревания неокортекса уже в постнатальном онтогенезе.
В неокортексе плодов и новорожденных с внутренней гидроцефалией с 22-й по 32-ю недели гестации обнаружена иммунонегативная реакция (0 баллов) с антителами к рилину. В 33-37 недель в наружном молекулярной слое (II) определялись единичные рилин-позитивные нейроны и неравномерно выраженное слабой интенсивности фоновое окрашивание нейропиля, которые во внимание не принимались, в связи с чем ИЭ гликопротеина не рассчитывался.
У доношенных новорожденных 38-40 недель гестации (все они жили до 4 недель) экспрессия рилина проявилась умеренным окрашиванием (2 балла) части нейронов (23%) наружного зернистого слоя и неравномерным желтовато-коричневатым колоритом нейропиля. При этом ИЭ рилина составил 0,46 усл.ед., что достоверно меньше, чем при вентрикуломегалии (p<0,05) и в группе сравнения (p<0,005).
Отсутствие синтеза рилина с 22-й по 37-ю недели гестации и низкое прижизненное значение ИЭ указанного гликопротеина у доношенных новорожденных сочетались не только с атрофией неокортекса, но и его глубокой незрелостью, которая, по нашим данным [2], проявлялась отсутствием дифференцировки нижнего этажа коры на цитоархитектонические слои.
Экспрессия BDNF в пирамидном слое моторной коры c 22-40 недели гестации проявилась слабовыраженным окрашиванием (1 балл) пирамидных нейронов, а ИЭ составил 1,5 усл.ед., что ниже аналогичных параметров групп сравнения и вентрикуломегалии (р ˂ 0,05). Выявлено, что снижение экспрессии нейротрофного фактора сопровождается повреждением ультраструктур нейронов в неокортексе изучаемых отделов головного мозга [2].
Выводы:
1. Период наиболее интенсивного синтеза рилина нейронами Кахаля-Ретциуса - 22-27 недели пренатального онтогенеза - совпадает со спуртом гирификации неокортекса и становлением цитоархитектоники моторной коры. Экспрессия BDNF в наружном пирамидном слое увеличивается пропорционально сроку гестации, что сопровождается постепенным созреванием нейронов пирамидного слоя.
2. При вентрикуломегалии достоверно-значимое понижение синтеза рилина клетками Кахаля-Ретциуса сопровождается запаздыванием гирификации больших полушарий головного мозга на 2-3 недели и замедлением формирования цитоархитектоники моторной коры до 33-й недели внутриутробного развития, что указывает на дисхронное развитие неокортекса. Однако выраженная экспрессия BDNF в пирамидном слое свидетельствует о компенсаторном повышении синтеза нейротрофина, направленного на поддержание процессов дифференцировки и созревания нейронов.
3. При врожденной гидроцефалии выявлены нарушение синтеза рилина клетками Кахаля-Ретциуса и снижение экспрессии BDNF, сопровождающиеся нарушением гирификации (микрополигирия), глубокой незрелостью моторной коры в виде отсутствия дифференцировки нижнего этажа неокортекса на цитоархитектонические слои и незрелостью пирамидных нейронов.
Список литературы
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика / пер. с англ. - М., 1999.- 460 с.
2. Перетятко Л.П., Кулида Л.В., Проценко Е.В. Морфология плодов и новорожденных с экстремально низкой массой тела. Иваново: ОАО «Издательство «Иваново», 2005. 384 с.
3. Проценко Е.В., Васильева М.Е., Перетятко Л.П. Критерии дифференциальной морфологической диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии у плодов и новорожденных с экстремально низкой массой тела // Мать и Дитя в Кузбассе, 2014. - № 2 (57). – С. 104-108.
4. Проценко Е.В., Васильева М.Е., Перетятко Л.П., Малышкина А.И. Морфологические изменения перивентрикулярной зоны и неокортекса больших полушарий головного мозга у плодов человека и новорожденных с 22-й по 40-ю недели пренатального онтогенеза // Онтогенез, 2014. – Т. 45. - № 5. – С.349- 355 (англояз. вар. 287-292).
5. Проценко Е.В., Васильева М.Е., Перетятко Л.П., Назаров С.Б., Малышкина А.И. Структурные изменения герминативного матрикса головного мозга у плодов и новорожденных с вентрикуломегалией и врожденной гидроцефалией // Архив патологии, 2014. – Т.76. - № 3- С. 9 -12.
6. Проценко Е.В., Перетятко Л.П. Морфологические критерии дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии у плодов 22-27 недель гестации // Актуальнi питання педiатрii, акушерства та гiнекологii, 2011. –№ 2 (8). – С. 103-108.
7. Проценко Е.В., Перетятко Л.П., Васильева М.Е. Морфологические диагностические критерии внутриутробно приобретенной вентрикуломегалии // Вiсник морфологii, 2010. - № 16 (2). – 353-357.
8. Adachi N, Numakawa T, Richards M et al. New insight in expression, transport, and secretion of brain-derived neurotrophic factor: Implications in brain-related diseases // World J Biol Chem., 2014. - Nov 26. – V 5(4). – P. 409-428.
9. Förster E, Bock HH, Herz J et al. Emerging topics in Reelin function. // European Journal of Neuroscience, 2010. – V. 31(9). – Р. 1511–1518.
10. Kohno T., Nakano Y., Kitoh N. et al. C-terminal region-dependent change of antibody-binding to the Eighth Reelin repeat reflects the signaling activity of Reelin // J. Neurosci. Res., 2009. – V.87. – P. 3043–3053.
11. Park H, Poo MM. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function // Nat Rev Neurosci., 2013. – V. 14. – Р.7–23.
