КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПОЛНОГЕНОМНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК СТЕПЕНИ КОМПАКТИЗАЦИИ ХРОМАТИНА В ЛЕЙКОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С ГИПЕРТОНИЕЙ И ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

Введение

За последние годы стала очевидной взаимосвязь между различными нарушениями в эпигеноме, нестабильностью генома и возникновением ряда патологических состояний организма. У каждого живого организма собственный эпигенотип устанавливается на основе модификаций ДНК (метилирование и гидроксиметилирование цитозина), модификаций хроматина (метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, убиквитинилирование, сумоилирование и АДФ-рибозилирование гистонов) и разнообразной активности некодирующих РНК. Разные комбинации данных модификаций влияют на конформационные (степень компактизации/ремоделирование) и позиционные (локализация в трехмерном пространстве ядра) изменения хроматина и могут приводить как к транскрипционному сайленсингу (инактивации), так и увеличивать активность транскрипции генов [Эллис и др. 2010].

Характерная для эпигенома пластичность (в том числе обратимость) делает его достаточно легко перепрограммируемым в онтогенезе под действием внешних факторов (продуктами питания, фармакологическими препаратами, химическими и физическими факторами) [Паткин, 2008; Паткин, Квинн, 2010; Паткин, Софронов, 2015]. Эпигеномные/эпигенетические нарушения могут вносить свой вклад не только во время эмбрионального развития, но также в постнатальную патологию и даже заболевания, возникающие в зрелом возрасте, в частности быть одной из причин таких распространенных и социально значимых болезней сердечно-сосудистой системы как гипертония и ишемическая болезнь сердца [Hiltunen et al., 2002; Kim et al., 2010; Smolarek et al., 2010; Udali et al., 2013; Han et al., 2016]. В связи с этим в данной работе представлены результаты пилотного исследования по сравнительному анализу эпигеномных изменений (метилирование ДНК и ремоделирование хроматина) в лейкоцитах периферической крови у пациентов с гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца до и после курса фармакологического лечения с целью выявления новых молекулярных маркеров предрасположенности к данным заболеваниям и/или биомаркеров эффективности фармакотерапии.

Материалы и методы

В работе были исследованы образцы ДНК 24 мужчин (средний возраст 27.3±9.1 лет, M±SD) и 27 женщин (средний возраст 28.7±7.9 лет, M±SD) добровольцев, не состоящих в родстве и не имеющих каких- либо сходных заболеваний (в том числе сердечно-сосудистых) (контрольная выборка). Группа пациентов с гипертонической болезнью (ГБ) молодого возраста была представлена 14 мужчинами (средний возраст 31.9±6.2 лет, M±SD) и 10 женщинами (средний возраст 31.4±5.2 лет, M±SD). Группа пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) состояла из 19 мужчин (средний возраст 58.4±12.3 лет, M±SD) и 9 женщин (средний возраст 68.7± 10.2 лет, M±SD). Все добровольцы контрольной выборки и пациенты кардиологического отделения клиники «ИЭМ» были европеоидной расы (славяне по этнической принадлежности) и жителями Северо-Западного федерального округа России. От них было получено информированное согласие на проведение исследований в соответствии с требованиями этического комитета, принятыми и обнародованными ФГБНУ «ИЭМ».

В качестве стандартных образцов ДНК с известным уровнем полногеномного метилирования ДНК были использованы образцы коммерческой неметилированной и метилированной ДНК человека («Human methylated and non-methylated DNA Set», «Zymo Research»). Неметилированная форма ДНК получена из клеточной линии HCT116 DKO, которая является генетическим нокаутом по двум ДНК метилтрансферазам (DNMT1 и DNMT3b). ДНК этих клеток имеет низкий уровень метилирования (< 5% CpG) и поэтому часто используется как негативный контроль при анализе метилирования CpG динуклеотидов. Метилированная форма ДНК (100% CpG) этой же клеточной линии получена фирмой-производителем in vitro с помощью CpG-метилазы и служит в качестве позитивного контроля при анализе метилирования CpG динуклеотидов. На основе коммерческой неметилированной и метилированной ДНК был сделана серия стандартных образцов, моделирующих 12.5%, 37.5%, 50.0 %, 62.5%, 75.0%, 87.5% уровни полногеномного метилирования ДНК.

Получение лейкоцитарной массы, выделение геномной ДНК. Забор венозной крови (5 мл) проводили     в пробирки с «K+-EDTA» («Sarstedt»). Венозную кровь инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Плазму со слоем лейкоцитарной массы переносили в 2 мл пробирки и центрифугировали при 100g в течение 10 мин. Удаляли надосадочную жидкость (сыворотку), осадок лейкоцитов ресуспендировали в 900 мкл гипотонического раствора (0.5% KCl) и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Затем каждый образец делили на 2 части (по 450 мкл): на выделение геномной ДНК и на получение ядер. Центрифугировали при 100g в течение 5 мин. Удаляли гипотонический раствор. К полученным осадкам лейкоцитов в одну пробу добавляли по 700 мкл буфера для выделения ДНК с протеиназой К, а в другую (образец для ДНКаза I обработки) - по 50-100 мкл 1хPBS (Суспензию ядер хранили при -200С). Геномной ДНК получали с помощью бесфенольной хлороформной экстракции [Сучкова и др., 2016]. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически. Для последующей работы все исследуемые образцы были стандартизированы по концентрации ДНК (50 нг/мкл). Концентрацию ядер для последующей обработки ДНКазой I оценивали в камере Горяева.

Метил-чувствительная рестрикция с использованием ImageJ анализа (Methylation Sensitive Restriction-ImageJ Assay, MSR-IA). Данная методика является оптимизированным вариантом [Сучкова и др., 2016] классического биохимического подхода по анализу метилирования ДНК, основанного на чувствительности эндонуклеаз рестрикции к метилированному цитозину [Waalwijk, Flavell, 1978], с использованием современного программного обеспечения ImageJ [Rasband, 1997-2015; Abramoff et al., 2004; Schneider et al., 2012]. Ферментативный гидролиз ДНК проводили с помощью метил-чувствительных эндонуклеаз рестрикции MspI и HpaII, следуя рекомендациям фирмы-производителя ферментов («Thermo Scientific»). Для одного и того же исследуемого образца ДНК в опыт брали три варианта: образец с MspI, с HpaII и без добавления ферментов. Последний вариант служил контролем сохранности ДНК в реакционном буфере. Электорофорез образцов ДНК проводили в 1,0% агарозном геле на 0.5хТВЕ в течение 50 минут при силе тока 40mA. ДНК визуализировали окрашиванием бромистым этидием (1мкг/мл) в течение 15 минут. Просмотр геля осуществляли с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали на цифровую камеру. Далее проводили количественный анализ полученных изображений с помощью программы ImageJ. Для каждого исследуемого образца делали по 5 измерений. Относительные значения уровня метилирования ДНК, выраженные в условных единицах ImageJ, получали отношением абсолютных значений флуоресценции для лунки «MspI» к значению для «HpaII». Затем для всех исследуемых образцов устанавливали относительный уровень полногеномного метилирования ДНК по CCGG сайтам, выраженный в процентах, используя коэффициенты уравнения линейной регрессии (Y=a+bX, Y = 397.181X - 374.490) (R = 0,990), полученные на основе 8 стандартных образцов ДНК с известным уровнем метилирования ДНК.

Определение степени полногеномной компактизации хроматина с помощью ДНКазы I и ImageJ    анализа (Genome-wide Chromatin State DNaseI Sensitive Assay, GWChS-DNase-SA). Данная методика является модифицированным вариантом классического биохимического подхода, основанного на чувствительности ДНК к ДНКазе I [Кирьянов, 1983; Ling, Waxman, 2013], с использованием современного программного обеспечения ImageJ [Rasband, 1997-2015; Abramoff et al., 2004]. Обработку хроматина (~104 ядер/проба) ДНКазой I проводили в 30 мкл реакционной смеси (10 mМ Tris-HCl, pH 7.5 при 250С; 2.5 mМ MgCl2; 0.1 mМ СaCl2; 0,009 ед/мкл ДНКаза I) («Thermo Scientific») в течение 5 минут при +150С. Для одного и того же исследуемого образца ядер в опыт брали два варианта: проба с ДНКазой I и проба без фермента. Контролем полноты обработки ДНКазой I служил образец ДНК (в количестве 1000 нг/проба). Реакцию останавливали добавлением 1/10 объема 0.5 М ЭДТА и инкубировали во льду в течение нескольких минут. Затем  из  этих  образцов  выделяли  ДНК  с  помощью  протеиназной  обработки  и  однократной депротеинизацией раствором хлороформ:изоамиловый спирт (24:1, v/v). ДНК растворяли в 18 мкл бидистиллированной воды. Электорофорез образцов ДНК проводили в 1,0% агарозном геле на 0.5хТВЕ в течение 50 минут при силе тока 40mA. ДНК визуализировали окрашиванием бромистым этидием (1мкг/мл) в течение 15 минут. Просмотр геля осуществляли с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали на цифровую камеру. Далее проводили количественный анализ полученных изображений с помощью программы ImageJ. Относительные значения степени компактизаци хроматина получали отношением абсолютных значений для лунки «DNaseI» к значению для «buffer». Для каждой дорожки делали по 5 измерений. Затем для опытных образцов с неизвестной степенью компактизации хроматина устанавливали относительный уровень гетерохроматинизации, выраженный в процентах, используя коэффициенты уравнения линейной регрессии (Y=a+bX, Y = 226.466X - 128.121; R = 0.983), полученные по опорным точкам для 0% гетерохроматина (для этого служили значения «голой» ДНК по 8 экспериментам) и 100% гетерохроматин (1 у.е. флуоресценции ImageJ).

Статистическая  обработка  данных.          Статистическую     обработку     данных     проводили     с использованием непараметрических критериев Крускала-Уоллиса (Н) (сравнение 5 групп) с последующим попарным сравнением с помощью критерия Данна (Q) с поправкой Бонферрони на множественность сравнений. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В представленной работе с помощью методов MSR-IA и GWChS-DNase-SA была проведена количественная оценка полногеномного метилирования ДНК по CCGG сайтам и степени компактизации хроматина в лейкоцитах периферической крови в норме и у пациентов с гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца до и после недельного (персонифицированного) курса фармакологического лечения.

Результаты проведенного молекулярно-генетического исследования показали, что в контрольной выборке индивидов без сердечно-сосудистых заболеваний нет статистически значимых различий между мужчинами и женщинами как по уровню полногеномного метилирования ДНК, так и степени компактизации хроматина в лейкоцитах периферической крови. По сравнению с контролем в исследованных группах пациентов с ГБ и ИБС было выявлено статистически значимое повышение уровня полногеномного метилирования ДНК у мужчин (H=14.841, df =4, p=0.005) и женщин (H=14.841, df =4, p=0.005). При этом до проведения курса фармакотерапии в стационаре у женщин с ГБ наблюдалось более выраженное повышение метилирования ДНК (примерно в 1.6 раза, р < 0.001), чем у мужчин с ГБ (примерно в 1.4 раза, р = 0.013) по сравнению с контролем (Рис.1).

Рисунок 1. Относительный уровень полногеномного метилирования ДНК (по CCGG сайтам) в лейкоцитах периферической крови у пациентов с гипертонической болезнью (ГБ) и ишемической болезнью сердца (ИБС) до и после недельного курса фармакотерапии. Данные представлены как медиана и 25-ый и 75-ый процентили (Q1-Q3 квартили), отмечены границы минимальных и максимальных значений, точкой указаны выскакивающие значения. Статистически значимые различия по сравнению с контролем отмечены * при р = 0.013 и ** при р < 0.001.

Однако недельный курс терапии у мужчин с ГБ не привел к существенным изменениям в уровне метилирования ДНК, тогда как у женщин с ГБ наблюдалось снижение метилирования ДНК до значений в контрольной группе. Следует отметить, что у пациентов с ИБС до курса фармакотерапии не было обнаружено статистически значимых различий в уровне метилирования ДНК по сравнению с контролем, хотя у мужчин с ИБС после курса фармакотерапии наблюдалось незначительное повышение уровня метилирования ДНК примерно в 1.1 раза (р = 0.013). Как показало наше исследование, проведенный курс фармакотерапии не привел к статистически значимым изменениям степени компактизации хроматина в исследованных группах с ГБ и ИБС (Таблица 1). В ряде публикаций также отмечали абберантное метилирования ДНК у пациентов с гипертензией и при этом наблюдались не только гендерные различия в уровне метилирования, но и различия в зависимости от тяжести заболевания. Кроме того, были получены данные, указывающие на нарушения модификации гистонов при атеросклерозе и ИБС, а также при фармакотерапии [Hiltunen et al., 2002; Kim et al., 2010; Smolarek et al., 2010; Webster et al., 2013; Schiano et al., 2015].

Таблица 1. Степень гетерохроматинизации в лейкоцитах периферической крови у пациентов с ГБ и ИБС до и после недельного курса фармакотерапии. Данные представлены как медиана и среднее абсолютное отклонение медианы (average absolute deviation from median).

Необходимо подчеркнуть, что представленные в данной работе результаты количественной оценки метилирования ДНК и степени гетерохроматинизации в лейкоцитах являются усредненными значениями по группам пациентов. Во многом в связи с этим регистрируются статистически незначимые различия между сравниваемыми выборками до и после лечения, тогда как если говорить об анализе эпигеномных изменений персонифицировано, то среди наблюдавшихся пациентов встречались индивиды, у которых фармакотерапия приводила к эпигеномным изменениям как на уровне метилирования ДНК (гипо- либо гиперметилирование), так и компактизации хроматина (эухроматинизация либо гетерохроматинизация), либо изменения затрагивали только метилирование ДНК, либо только хроматин. Кроме того, встречались индивиды, у которых не регистрировались какие-либо эпигеномные изменения в лейкоцитах периферической крови.

Заключение. Полученные данные указывают на важность персонифицированного подхода в анализе роли эпигеномных/эпигенетичеких изменений при различных патологических состояниях и в процессе подбора индивидуализированной терапии. Описанные методические подходы могут быть использованы в практической медицине и ветеринарии для выявления эпигеномных нарушений при различных патологиях.

*Представленная работа входит в рамки ПНИ «Молекулярно-генетические и клеточные основы патогенеза, диагностики и лечения социально значимых заболеваний инфекционной и неинфекционной природы» (шифр 0557-2016-0001).

Список литературы

1.        Кирьянов Г.И. Структура хроматина и энзиматическое метилирование ДНК. Диссертация на соискание ученой степени д.б.н., Москва. 1983, 258с.

2.        Паткин Е.Л. Эпигенетические механизмы распространенных заболеваний человека. СПб: Нестор-История, 2008. 200 с.

3.        Паткин Е.Л., Квинн Дж. Эпигенетические механизмы предрасположенности к комплексным патологиям человека // Экологическая генетика. 2010. Т. 8(4). С. 44-56.

4.        Паткин Е.Л.,      Софронов Г.А. Эколого-зависимые заболевания человека. Эпигенетические механизмы возникновения и наследования // Мед. акад. журнал. 2015. Т. 15 (3). С. 7-23.

5.        Сучкова И.О., Дергачева Н.И., Павлинова Л.И., Сасина Л.К., Баранова Т.В., Паткин Е.Л. Количественное определение полногеномного метилирования ДНК с помощью метил- чувствительной рестрикции и IMAGEJ анализа (MSR-IA) // Межд. науч.-исслед. журнал. 2016.Т. 4-5 (46). С. 41-46.

6.        Эллис С.Д., Дженювейн Т., Рейнберг Д. Эпигенетика М.: Техносфера, 2010. 496 с.

7.        Abramoff M.D., Magalhaes P.J., Ram S.J. Image Processing with ImageJ // Biophotonics International. 2004. V. 11(7). P. 36-42.

8.        Han L., Liu Y., Duan S. et al. DNA methylation and hypertension: emerging evidence and challenges // Briefings in Functional Genomics. 2016. P. 1-10.

9.        Hiltunen M.O., Turunen M.P., Hakkinen T.P. et al. DNA hypomethylation and methyltransferase expression in atherosclerotic lesions // Vasc. Med. 2002. V.7. P.5-11.

10.     Kim M., Long T.I., Arakawa K. et al. DNA methylation as a biomarker for cardiovascular disease risk  // PLoS ONE. 2010. V.5(3): e9692.

11.     Ling G., Waxman D.J. DNase I digestion of isolated nulcei for genome-wide mapping of DNase hypersensitivity sites in chromatin // in Gene Regulation: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology / ed. Minou Bina, 2013. V. 977. Chap.3. P.21-34.

12.     Rasband W.S., ImageJ U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, 1997-2015 (http://imagej.nih.gov/ij).

13.     Schiano С., Vietri M.T., Vincenzo Grimaldi V. et al. Epigenetic-related therapeutic challenges in cardiovascular disease // Trends in Pharmacological Sciences. 2015. V. 36 (4). P. 226-235.

14.     Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis // Nature Methods. 2012. V. 9. P. 671-675.

15.     Smolarek I., Wyszko E., Barciszewska A.M. et al. Global DNA methylation changes in blood of  patients with essential hypertension // Med. Sci. Monit. 2010. V.16:CR149-5.

16.     Udali S., Guarini P., Moruzzi S. et al.Cardiovascular epigenetics: from DNA methylation to microRNAs // Molecular Aspects of Medicine. 2013. V. 34. P. 883-890.

17.     Waalwijk С., Flavell R.A. MspI an isoschizomer of HpaII which cleaves both unmethylated and methylated HpaII sites // Nucleic Acids Res. 1978. V. 5. P. 3231-3236.

18.     Webster A.L.H., Yan M. S-C., Marsden F.A. Epigenetics and cardiovascular disease // Canadian J. Cardiology. 2013. V. 29. P. 46-57.