ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЛАКТОБАКТЕРИЙ В ВАГИНАЛЬНЫХ МАЗКАХ ЖЕНЩИН Г.ИВАНОВО

Лактобактерии являются одним из основных  компонентов влагалищной микрофлоры. Считается, что именно эти бактерии играют ключевую роль в поддержании здоровья и нормального функционирования женской репродуктивной системы. Нарушение вагинальной микробной экосистемы обычно сопровождается снижением количества лактобацилл и чрезмерным ростом анаэробов. Основы экологии вагинальной микробиоты, а именно, состав, относительное преобладание и временные колебания бактериальных видов, в том числе лактобацилл, изучены слабо.

Применение геномных технологий изменило наши представления как о бактериальном составе вагинальной экосистемы в целом, так и о видовом составе вагинальных лактобактерий. Выяснилось, что бактериальный состав вагинальной микробиоты представлен несколькими сотнями различных видов, при этом доминирующими видами вагинальной микрофлоры являются не Lactobacillus acidophilus, как считалось в течение многих десятилетий, а целый спектр Lactobacillus spp., среди которых наиболее распространенными у здоровых женщин являются четыре вида: L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii и L. iners (Srinivasan et al. 2012, Smith et al. 2012, Romero et al. 2014). Наряду с упомянутыми видами иногда сообщают о выявлении в вагинальном содержимом и других видов лактобактерий, например, L. acidophilus (Burton et al. 2003, Vitali et al. 2007), L. helveticus и L. vaginalis (Vitali et al. 2007, Srinivasan et al. 2012, Romero et al. 2014). Роль различных видов лактобацилл в поддержании здоровья влагалища и особенность их распространения остается неясной и является предметом интереса. Таким образом, видовая идентификация и количественное определение лактобактерий могут служить полезным диагностическим показателем и содействовать разработке подходов по использованию лактобактерий в качестве биомаркера вагинального здоровья в клинических условиях.

Целью настоящей работы являлась оценка видового разнообразия и распространенности различных видов лактобактерий в вагинальных образцах, отобранных у женщин г. Иваново Владимирской области.

Видовую идентификацию лактобактерий и их количество в образцах проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием тест-систем ООО «НаноДиагностика» для научного применения, собранных на основе разработанной нами диагностической панели, обеспечивающей определение общего количество бактериальной ДНК, групповую индикацию всех видов вагинальных лактобактерий, идентификацию и количественную детекцию индивидуальных видов L.iners, L.crispatus, L.jensenii, L.gasseri, L.acidophilus, L.helveticus. Анализ  проводился в 3-х мультиплексных реакциях. Оценку показателей количества лактобактерий нормировали по отношению к общей бактериальной массе. Всего было исследовано 153 вагинальных мазка, взятых у женщин в возрасте от 18 до 56 лет, обратившихся в медицинские учреждения г. Иваново в гинекологические отделения для обследования. Выборка включала в себя 66 женщин без видимых нарушений и жалоб, из которых 22 были беременны, а остальные женщины имели различные воспалительные, инфекционные или другие патологические процессы в области органов малого таза.

Результаты определения распространенности различных видов лактобактерий приведены в Табл.1. В 4-х образцах лактобактерии не были обнаружены, при этом уровень бактериальной ДНК был достаточно высоким. Еще у 4-х женщин лактобактерии были выявлены в ПЦР с группо-специфич–ным зондом, но не давали сигнала с видоспецифичными зондами, что свидетельствовало о наличии лактобактерий, не относящихся к детектируемым видам. Остальные пробы содержали лактобактерии, относительное количество которых к общей бактериальной массе варьировало от 100% до 0,00001%. Следует заметить, что концентрации лактобактерий меньше, чем 0,1% могут быть зафиксированы только методом количественной ПЦР и не определяются микробиологическими методами, связанными с культивированием, или методами высокопроизводительного секвенирования (NGS). Другими словами, при использовании других методов, такие образцы также попали бы в группу отрицательных по лактобактериям. Образцов с относительным содержанием лактобактериальной ДНК менее 0,1% было 12. Интересно, что распределение среди них образцов от практически здоровых и от женщин с различными патологиями в области малого таза было примерно в равной пропорции – 5 и 7, соответственно.

Таблица 1  

Видовое разнообразие лактобактерий в вагинальных образцах.

В группе образцов с относительным содержанием лактобактерий более, чем 0,1% (137 образцов) были обнаружены 4 вида лактобактерий, которые по частоте встречаемости расположились в следующем порядке (по убыванию): L. iners, L. crispatus, L. jensenii, L. gasseri. Какой либо взаимосвязи между колонизирующим видом лактобактерий и наличием патологического процесса в области малого таза замечено не было, однако следует заметить, что в группе женщин с патологическими процессами была увеличена доля лактобактерий L. iners и L.   jensenii. Для окончательных выводов требуется более детальное исследование на большей выборке. В 35 образцах было выявлено 2 и даже 3 вида лактобактерий.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является общепризнанным методом для обнаружения и количественного определения многих микроорганизмов. Для вагинальных лактобактерий было разработано несколько методов на основе технологии ПЦР в реальном времени. Большинство методов амплификации лактобактерий построено на моноспецифическом принципе детекции, но имеется по крайней мере одна попытка мультиплексного определения 4-х основных видов вагинальных лактобактерий на основе гена tuf (Balashov et al. 2014). Мультиплексная ПЦР имеет преимущество перед моноплексной ПЦР, поскольку обеспечивает определение нескольких видов одновременно в одной реакции, что делает анализ менее дорогими и ресурсоемким.

Разработанная в лаборатории моекулярной диагностики ИМГ РАН панель диагностических ПЦР тест- систем, обеспечивающих как видовую идентификацию всех основных видов вагинальных лактобактерий, так и определение их количественной нагрузки в образце, продемонстрировала высокие диагностические показатели и широкие возможности по идентификации и количествен–ной оценке основных вагинальных лактобактерий.

Заключение.

Лактобактерии являются практически обязательным компонентом вагинальной микробиоты, хотя их концентрация может быть значительно снижена. В Российской популяции женщин г. Иваново, как и в других странах, наиболее распространенными видами вагинальных лактобактерий являются L. iners, L. crispatus, L. jensenii, L. gasseri, два вида из которых - L. iners и L. crispatus встречаются у 90% женщин, проходящих обследование у гинекологов.

Список литературы

1.     BALASHOV SV, MORDECHAI E, ADELSON ME, SOBEL JD AND GYGAX SE. 2014. Multiplex quantitative polymerase chain reaction assay for the identification and quantitation of major vaginal lactobacilli. Diagnostic microbiology and infectious disease 78: 321-327.

2.     BURTON JP, CADIEUX PA AND REID G. 2003. Improved understanding of the bacterial vaginal microbiota of women before and after probiotic instillation. Applied and environmental microbiology 69: 97-101.

3.     ROMERO R ET AL. 2014. The composition and stability of the vaginal microbiota of normal pregnant women is different from that of non-pregnant women. Microbiome 2: 4.

4.     SMITH BC ET AL. 2012. The cervical microbiome over 7 years and a comparison of methodologies for its characterization. PloS one 7: e40425.

5.     SRINIVASAN S ET AL. 2012.  Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PloS one 7: e37818.

6.     VITALI B, PUGLIESE C, BIAGI E, CANDELA M, TURRONI S, BELLEN G, DONDERS GG AND BRIGIDI P. 2007. Dynamics of vaginal bacterial communities in women developing bacterial vaginosis, candidiasis, or no infection, analyzed by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis and real-time PCR. Applied and environmental microbiology 73: 5731-5741.