ОЦЕНКА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ – ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ДЕСТРУКТОРОВ БЕЛКОВЫХ СУБСТРАТОВ

Способность микроорганизмов разрушать различные вещества широко используются в настоящее время в биотехнологии для удаления пестицидов [1], нефтяных загрязнений [2], переработке отходов различных производств, в том числе белоксодержащих [3 - 5]. Микроорганизмы-деструкторы, воздействуя на различные объекты, вызывают повреждения последних, изменяя их структурные и функциональные характеристики [6]. Биодеструкторы способны быстро адаптироваться к различным материалам как к источникам питания, условиям внешней среды и к средствам защиты. Поиск биодеструкторов и изучение особенностей их воздействия на различные объекты позволяет с одной стороны, оценить биодеградирующий потенциал микроорганизмов, а с другой – выбрать штаммы, перспективные в дальнейшем для биоконверсии различных веществ. Целью настоящей работы являлась сравнительная оценка биодеградирующих свойств некоторых дейтеромицетов при росте на различных белоксодержащих субстратах.

В качестве биообъектов использовались дейтеромицеты из музейной коллекции ФГБНУ ВИЛАР: Aspergillus flavus (штамм № 52), Aspergillus versicolor (штамм № 20 и 26), Penicillum pubirullum (штамм № 16), Phialophora verrucosa (штамм № 12) Penicillium citrinum (штамм № 54). Для указанных штаммов A. flavus и P. citrinum ранее была показана способность к синтезу протеолитических ферментов с различной субстратной специфичностью [7, 8]. Культуры дейтеромицетов выращивали на скошенной поверхности агаризованной среды Чапека в течении 7- ми суток в термостате при 260С. Для оценки биодеструктивной способности штаммов использовали чашечный скрининг-метод с определением зон лизиса, индекса лизиса [9], а также размера колоний и скорости роста культур.

В качестве белковых субстратов использовали образцы нативной и модифицированной кожи из хвостов белых беспородных крыс-самок (120-150 г). Модифицированную кожу получали ранее описанным способом [10, 11]. Образцы ткани тщательно измельчали, промывали водой, обезжиривали смесью хлороформ – метанол (1:1) и высушивали на лиофильной сушке «Edvards» до постоянного веса. Высушенные образцы измельчали в блендере.

Для проведения поверхностного культивирования использовали агаризованные среды, содержащие солевой фон среды Чапека с заменой сахарозы на 2% соответствующего белкового субстрата.

Культивирование в глубинных условиях осуществляли в колбах объемом 300 мл с 100 мл питательной среды на качалке при скорости вращения 220 об/мин при 260С. Посевным материалом служила суспензия спор семисуточных культур дейтеромицета. Количество посевного материала составляло 2,6-3,6x108 спор на 100 мл среды. Культивирование осуществляли на модифицированной среде Чапека с частичной заменой сахарозы на белковый субстрат из нативной кожи (0,5% сахарозы и 1,5% белка). Протеолитическую активность определяли, как это описано ранее, используя в качестве субстратов коллаген или жидкий кератин [8].

Полученные результаты (Табл.1) свидетельствуют о том, что все исследованные культуры росли на среде с белками нативной кожи и образовывали заметные зоны лизиса. Наибольшие скорости роста на начальных этапах культивирования отмечались у A. flavus и P. pubirullum, однако к седьмым суткам рост культур практически останавливался. При сравнении максимальных диаметров колоний впервые изучаемых нами дейтеромицетов с тем же показателем у P. citrinum – продуцента протеолитических ферментов [8] при росте на белках нативной кожи не выявлено существенных различий. Поэтому на основании только данных о росте культур на указанном субстрате осуществить выбор потенциального продуцента протеаз не представлялось возможным.

Ранее нами было предложено [11] в качестве дополнительного критерия при отборе перспективных продуцентов протеаз использовать модифицированные формальдегидом белковые субстраты. Можно видеть (Табл.2), что на среде с белками модифицированной кожи рост культур отмечался только у P. citrinum, продуцента протеаз, и у двух штаммов A. versicolor. Эти же штаммы к концу культивирования образовывали зоны лизиса.

На основании полученных результатов оба штамма A. versicolor были выбраны для проведения глубинного культивирования с целью дополнительной оценки их протеолитической активности и способности секретировать протеазы в культуральную жидкость. В качестве индукторов синтеза ферментов использовали препараты нативной кожи, в состав которой входят коллаген и кератин. Можно видеть (Табл.3), что оба штамма A. versicolor секретировали в культуральную жидкость протеиназы с коллагено- и кератинолитической активностью, несколько меньшей, чем у ранее изученного нами штамма P. citrinum.

Максимальная протеолитическая активность культуральной жидкости микромицетов

Таким образом, все исследованные штаммы мицелиальных грибов являлись деструкторами белков кожи. Способностью к росту на модифицированных субстратах обладали только P. citrinum и два штамма A. versicolor, что могло свидетельствовать об их более высоком протеолитическом потенциале. Культивирование в глубинных условиях подтвердило, что эти микромицеты секретируют как кератинолитические, так и коллагенолитические ферменты. Предложенный способ проведения скрининговых исследований с использованием субстратов с повышенной устойчивостью к протеазам позволил выявить потенциальных продуцентов указанных ферментов.

Список литературы

1.     Широких A.A., Колупаев A.B. Грибы в биомониторинге наземных экосистем / Теоретическая и прикладная экология. 2009. № 3. С. 4—14

2.     Сидоренко О.Д., Лубников С.И., Павликова Т.А. // Патент России № 2264357, 20.04.2005

3.     Onifade A.A., Al-Sane N.A., Al-Mussallam A.A. A review: potentials for biotechnological application of keratin- degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resorurces // Bioresource Technol. 1998. V. 66. P. 1-11

4.     Касаткина, А.Н. Использование мультиэнзимных композиций для деструкции пивной дробины // Биотехнология. 2008. № 2. С. 59-65

5.     Башишкина Е.В., Панфилов В.И., Шакир И.В. и др. // Патент России № 2393719, 10.07.2010, Бюл. № 19, 5с.

6.     Семенов С.А., Гумаргалиева К.З., Заиков Г.Е. Биоповреждения материалов и изделий техники / Горение, деструкция и стабилизация полимеров, под ред. Заикова Г.Е. М: Научные основы и технологии. 2008. 422с

7.     Никитина З.К., Сухосырова Е.А.. Яковлева М.Б, Вещикова Е.В, Быков В.А.. Выделение, очистка и некоторые свойства коллагенолитических ферментов, секретируемых Aspergillus flavus //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2008, № 2, С.46-49.

8.     Никитина З.К., Гордонова И.К. Выделение, очистка и биохимические свойства кератинолитического фермента, секретируемого Penicillium citrinum // Вопросы биол., медиц. и фармацевтич. химии. 2013. № 9. с.36-41

9.     Яковлева М.Б., Козельцев В.Л. Протеолиз коллагена некоторыми видами микромицетов и спорообразующих бактерий //Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. № 1. С. 121-126

10. Яковлева М.Б., Зон Х.Ч., Никитина З.К., Быков В.А. Рост и синтез внеклеточных ферментов некоторыми видами дейтеромицетов на нативных и модифицированных белковых субстратах // Вопросы биол., медиц. и фармацевтич. химии. 2009. №1. С. 6-10.

11. Гордонова И.К., Никитина З.К., Зон Х.Ч., Томашевич С.В., Быков В.А. Изучение протеолитических свойств дейтеромицетов при росте на модифицированных и немодифицированных кератинсодержащих субстратах.// Вопросы биол., медиц. и фармацевтич. химии. 2009. №1. С. 19-24.