ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕМОСТАТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ТРОМБИНА ПРИ ЕГО МЕСТНОЙ АППЛИКАЦИИ НА РАНЕВУЮ ПОВЕРХНОСТЬ ПЕЧЕНИ КРОЛИКА

Актуальность исследования.

Согласно данным ВОЗ, каждого 20 из 100 погибших можно было спасти, если бы им была оказана адекватная первая помощь [4, 6]. По статистике, при травме около 30 % случаев летального исхода связано с тяжелой кровопотерей. В Российской Федерации ежегодные потери от дорожно-транспортных происшествий составляют 32–36 тысяч погибших и 220–250 тысяч раненых, что в 3–5 раз выше по сравнению с экономически развитыми странами. Во время Великой Отечественной войны 32,6 % (по некоторым данным до 50 %) умерших на поле боя гибли от кровопотери. В условиях ракетно-ядерной войны особенно возрастает значение капиллярно- паренхиматозных кровотечений, способствующих значительной кровопотере [1].

Тромбин — сериновая протеиназа семейства трипсина, гликопротеид, обладающий протеолитической активностью, эффективность которого проявляется в условиях нормального содержания фибриногена в крови [7, 11, 15]. Кроме превращения фибриногена в фибрин, он является также мощным активатором агрегации и адгезии тромбоцитов [5]. При действии тромбина на тромбоциты уже через 5 секунд после стимуляции происходит изменение формы клетки, централизация гранул, секреция их содержимого в систему открытых каналов и далее во внеклеточную  среду [2,  8,  9, 12, 13,  14]. Вследствие  мощного действия и опасности тромбоза, тромбин применяется только местно. Обычно наносится в виде растворов (100 ЕД/мл при поверхностных ранах и 1000– 2000 ЕД/мл при профузных кровотечениях), в виде порошка.

Рекомбинантный фактор VIIa (рФVIIa), международное название ЭПТАКОГ АЛЬФА, производится фирмой «NovoNordisk» (Дания) под коммерческим названием NovoSeven®. Препарат получен с помощью современной генно-инженерной технологии [3]. Он способствует локальной генерации тромбина, стимулируя зависимый «внешний» путь свертывания крови [10]. Второй специфической чертой препарата NovoSeven® является то, что его терапевтический эффект начинается при дозах, до 10 раз превышающих физиологические концентрации эндогенного ФVII, приводя к массивному образованию тромбина — «тромбиновый взрыв». Обильная генерация тромбина необходима для законченного гемостаза [3, 10].

Цель исследования.

Оценить эффективность гемостатического действия тромбина в различных фармакологических формах при травме печени кролика в эксперименте.

Материалы и методы.

В качестве исследуемого образца был выбран тромбин, предоставленный ООО «Технология Стандарт», Россия (патент на изобретение № 2457248 РФ). Образцом сравнения служил зарубежный препарат NovoSeven®, произведённый компанией «NovoNordisk», Дания. Для более детального исследования гемостатических свойств препарата тромбина использовалось несколько способов его нанесения на экспериментальную раневую поверхность: порошок тромбина наносился непосредственно на рану, порошок тромбина наносился на рану и фиксировался на ней при помощи марлевого тампона, на раневую поверхность наносился марлевый тампон, пропитанный 2 мл раствора тромбина в дистиллированной воде. Порошок препарата NovoSeven® наносился на рану и фиксировался на ней при помощи марлевого тампона.

Экспериментальная часть работы по оценке местной гемостатической эффективности исследуемых образцов проводилась на 20 кроликах породы «Шиншилла» обоего пола массой 3,0–4,5 кг со средним значением темпа кровотечения 1 г/мин согласно методике, описанной в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» Часть первая.-М.: Гриф иК, 2012. Эксперимент выполнялся с введения животного в состояние тиопенталового наркоза. Затем выполнялась тотальная срединная лапаротомия, в образовавшуюся рану выводилась передняя поверхность печени. При помощи пластмассового ограничителя производилась резекция лезвием выступившей части печени. В результате  образовывалась равномерно кровоточащая рана. В каждом опыте размер и форма срезанного сегмента оставались неизменными. Для сравнительной оценки гемостатических свойств исследуемого образца и контроля на доле печени одновременно производились два вышеописанных среза. В качестве контроля использовался марлевый тампон. Остановка капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполнялась путём нанесения на рану исследуемого образца. При этом контрольный марлевый тампон и образец полностью покрывали раневую поверхность. Эксперимент завершался внутривенным введением троекратной дозы тиопентала натрия, что обеспечивало гуманную эвтаназию животного.

Время остановки кровотечения (τ) определялось при помощи секундомера.

Определение объёма кровопотери (P) основывалось на измерении гравиметрическим методом массы истечённой крови из раны. Для облегчения пересчёта массы в объём было принято допущение, что плотность крови составляет 1 г/мл. Исследуемый образец, предварительно взвешенный на аналитических лабораторных весах с приборной погрешностью ±0,1 мг, равномерно наносился на всю площадь раневой поверхности. Пропитанный кровью образец снимался с раны и повторно взвешивался после остановки кровотечения. Объём кровопотери (P) определялся по формуле: P = (МK – M0) × ρ, где M0 — первоначальная масса исследуемого образца (г), MK — масса образца с кровью (г), ρ — плотность крови.

Гемостатическая активность (HA) является основным параметром, характеризующим оперативность остановки кровотечения исследуемым образцом по отношению к контрольному марлевому тампону. Гемостатическая активность (HA) определялась по формуле: HA = (1-[M2/M1]) × 100 %, где M2 — масса кровопотери при наложении образца (г), M1 — масса кровопотери при наложении контроля (г). Из формулы видно, что HA < 100 %.

В связи с различной анатомической локализацией контрольных и опытных участков геморрагий, могли возникнуть существенные отклонения в значениях измеряемых параметров. Но постоянная смена положения наносимых срезов и статистический анализ, проведённый при помощи программного обеспечения Prism® (GraphPad Software Ink, США), позволяли в значительной степени нивелировать эти отклонения.

Результаты и обсуждение.

Результаты исследования местной гемостатической активности различных доз порошка тромбина (150, 375, 750 и 1500 ед. NIH или 10, 25, 50 и 100 мг, соответственно) представлены в Табл.1.

Таблица1 Сравнительная оценка местной гемостатической активности тромбина при экспериментальной травме печени

* — достоверно по отношению к контролю при р < 0,05. Условные обозначения: МТ — марлевый тампон, ед. NIH — единицы активности тромбина, установленные Национальным Институтом Здравоохранения (The National Institute of Health), τ — время остановки кровотечения, P — объём кровопотери, HA — гемостатическая активность.

При нанесении порошка тромбина непосредственно на раневую поверхность было показано, что препарат вне зависимости от дозы смывался с раневой поверхности током крови уже в момент его нанесения и не проявлял гемостатического эффекта.

При условии фиксации порошка тромбина на раневой поверхности при помощи марлевого тампона наблюдался выраженный гемостатический эффект. Максимальная HA (87,09±2,46 %) была отмечена у тромбина в дозах свыше 750 ед. NIH (50 мг). Фиксация порошка позволяла тромбину запускать процесс тромбообразования на раневой поверхности. Образовавшиеся тромбы стабилизировались в местах поражения кровеносных сосудов, что обеспечивало оперативную остановку кровотечения.

Гемостатический эффект марлевого тампона, пропитанного раствором тромбина, был менее выражен. При максимальной дозе тромбина в растворе (100 мг или 1500 ед. NIH) показатель HA (70,51±3,37 %) совпадал с показателем HA (67,28±2,87 %) при фиксации 10 мг (150 ед. NIH) тромбина в форме порошка.

Сравнительная оценка гемостатической активности порошков тромбина и препарата NovoSeven® с их последующей фиксацией марлевым тампоном в дозе 2,5 мг на раневой поверхности показала, что значения HA препарата NovoSeven® (74,65±2,86 %) статистически не отличались от полученных при использовании порошка тромбина (375 ед. NIH) (77,42±4,69 %).

Значения времени остановки кровотечения и объёма кровопотери при использовании различных доз и способов нанесения препаратов полностью подтверждают выдвинутые гипотезы о протекании процесса тромбообразования.

Заключение.

Анализ полученных данных показал, что при местной аппликации порошка тромбина с фиксацией на раневой поверхности его гемостатическая активность возрастала в дозе 10 мг (150 ед. NIH) до 67,28±2,87 %. Максимальный гемостатический эффект (свыше 85 %) был достигнут при фиксировании марлевым тампоном порошка тромбина в дозах свыше 50 мг (750 ед. NIH). При таком способе наложения тромбина были зафиксированы: самое короткое время остановки кровотечения (до 21 с) и минимальный объём кровопотери (до 0,32 мл).

При нанесении на раневую поверхность раствора тромбина в дозе 25 мг (375 ед. NIH) его гемостатическая активность возрастала до 48,39±5,43 %. Растворы тромбина в дозах 50 мг (750 ед. NIH) и выше проявляли максимальную гемостатическую активность (свыше 64 %).

Сравнительная оценка местной гемостатической активности препаратов NovoSeven® и тромбина показала, что 2,5 мг NovoSeven® и 25 мг тромбина (375 ед. NIH), зафиксированных на ране марлевым тампоном, проявляют равную гемостатическую активность при их использовании в качестве гемостатиков местного действия.

Следовательно, можно заключить, что препарат тромбина в формах раствора и порошка, зафиксированного марлевым тампоном, является высокоэффективным местным гемостатическим средством для остановки капиллярно-паренхиматозных кровотечений.

Список литературы

1.     Вишневский А.А., Шрайбер М.И. Военно-полевая хирургия. Москва: Медицина, 1968. – 72 с.

2.     Кузник Б.И., Васильев Н.В., Цыбиков Н.Н. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма. Москва: Медицина, 1989. – 320 с.

3.     Плющ О.П., Копылов К.Г., Городецкий В.М. и др. Новая технология остановки и профилактики кровотечений в клинической практике // Вопросы гематологии/онкологии и иммунологии в педиатрии – 2003 – №2 – С.83–87.

4.     Радушкевич В.Л., Борисенко Л.В., Авдеева В.Г. и др. Первая медицинская помощь при дорожно- транспортных происшествиях. Учебно-методическое пособие для спасателей МЧС России – Воронеж: ЛИО. – 2006. – 100 с.

5.     Струкова А. А. Тромбин - регулятор процессов воспаления и репарации тканей // Биохимия. – 2001. – T. 66.– C. 14–27.

6.     Чурсин А.А. Важность информации о состоянии здоровья VIP для сотрудников личной охраны // БДИ (Безопасность, Достоверность, Информация). – 2006. – №3. – С. 38–39.

7.     Badimon L., Bаdimon J. J., Lassiba R. et al. Thrombine regulation of platelet interaction with damaged vessel wall and isolated collagen type 1 et arterial from condition is a porcine model; effect of girudines, heparin and calcium chelation // Blood. – 1991. – V. 78, N 3. – P. 423–434.

8.     Coughlin S. R. How the protease thrombin talks to cells // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1999. – V. 96, N 20. – P. 11023–11027.

9.     Diaz-Ricart M., Estebanell E., Lozano M. et al. Thrombin facilitates primary platelet adhesion onto vascular surfaces in the absence of plasma adhesive proteins: studies under flow conditions // Haematologica. – 2000. – V. 85, N 3. – P. 280–288.

10. Hoffman M., Monroe D. M. A cell-based model of hemostasis // Tromb, Hemost. – 2001 – Т.85 – №6 – Р.958– 965.

11. Kassels H., Willems G., Hemker H. C. et al. Analysis of thrombin generation in plasma // Comput. Biol. Med. – 1994. – V. 24, N 4. – P. 277–288.

12. Mannucci P.M. Drug therapy: hemostatic drugs // N. Engl. J. Med. – 1998. – V. 339, №4. – Р. 245–253.

13. Maragoudakis M. E., Tsopanoglou N. E. On the mechanism(s) of thrombin induced angiogenesis // Adv. Exp. Med. Biol. – 2000. – V. 476. – P. 47–55.

14. Ofosu F. A. The blood platelet as a model for regulating blood coagulation on cell surfaces and its consequences // Biochemistry (Mosc). – 2002. – V. 67, N 1. – P. 47–55.

15. Uchida T., Shinya N., Kaetsu H. et al. Thrombih-carrying bioabsorbable synthetic nonwoven fabric // Патент ЕР 1563856 А1. – 17.08.2005.