Новости
09.05.2023
с Днём Победы!
07.03.2023
Поздравляем с Международным женским днем!
23.02.2023
Поздравляем с Днем защитника Отечества!
Оплата онлайн
При оплате онлайн будет
удержана комиссия 3,5-5,5%








Способ оплаты:

С банковской карты (3,5%)
Сбербанк онлайн (3,5%)
Со счета в Яндекс.Деньгах (5,5%)
Наличными через терминал (3,5%)

КОМПЛЕКСНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЗАЖИВЛЕНИЯ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЫ ПЕЧЕНИ У 18-ДНЕВНЫХ КРЫСЯТ В УСЛОВИЯХ ПРИМЕНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ «ТРЕПЕЛ» И «СУВАР»

Авторы:
Город:
Чебоксары
ВУЗ:
Дата:
14 апреля 2016г.

Патология печени по клиническим проявлениям и своим последствиям занимает ведущее место в гастроэнтерологии. Одной из актуальных проблем гепатологии являются травматические повреждения печени. В большинстве случаев (80-90%) пострадавшими с повреждениями печени являются дети.

Результаты многочисленных исследований показывают, что печень человека и млекопитающих имеет высокие регенераторные потенции. Но полного восстановления печени, даже в условиях стимуляции, в литературе не описано, что дало основание полагать, что восстановительный рост в постнатальном периоде не происходит [8]. В связи с этим и сегодня актуальным является поиск средств, стимулирующих регенерацию печени.

В последние годы интерес исследователей вызывают цеолиты Алатырьского месторождения Чувашской Республики. Работы ряда авторов определили, что цеолиты повышают стрессоустойчивость, нормализуют обмен веществ, улучшают показатели крови животных (2). Так же было установлено, что применение «Трепела» в животноводстве, особенно в комплексе с другими иммунокорректорами, способствует совершенствованию функциональных систем организма у млекопитающих (2,6). В частности, использование «Трепела» вместе с препаратом «Сувар» в ветеринарии приводит к ростостимулирующему и иммуностимулирующему эффекту (1).

Биомикроэлементный препарат «Сувар» был создан в Чувашском государственном университете имени И.Н. Ульянова. Он представляет собой смесь природных терпеноидов, смоляных кислот и микроэлементов. Практическое применение его в ветеринарии показало, что препарат обладает разносторонним положительным воздействием на многие органы и системы организма животных[3].

На основании изложенного выше целью статьи явилось изучение влияния биологически активных веществ

«Трепел» и «Сувар» на заживление механической травмы печени в раннем онтогенезе у крыс.

Материал и методы. В эксперименте были использованы 84 крысенка массой 18-24 г, которым на 18-й день жизни стальной иглой через кожу наносили прокол печени. Животным начиная с момента нанесения травмы к основному рациону питания добавляли препараты «Трепел» (из расчета 1,25 мг,кг) и «Сувар» (из расчета 50мг/кг массы). В качестве контроля были взяты крысята того же возраста, что и опытные, в количестве 82 животных. Животных выводили из эксперимента в сроки от 1 до 30 суток эфиром (в утренние часы с 7 часов 30 минут до 9 часов). При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР № 755 от 12. 08. 1977 г.

При обработке материала наряду с гистологическими методиками –окрасками гематоксилином и эозином, суданом 3 (5), применяли гистохимические реакции для определения кислотной и щелочной фосфатаз, СДГ, NADH и NADFH (4). Количественную оценку ферментативной активности гепатоцитов в динамике осуществляли фотометрированием, которое проводили в проходящем свете на микроскопе «Микромед» с фотонасадкой ФМЭЛ-1 и ФЭУ-79 и выходным напряжением усилителя 1200 В. Для получения монохроматичного пучка применяли интерференционный светофильтр с максимумом светопропускания на длине волны 620 нм. Регистрацию данных осуществляли при помощи цифрового вольтметра Щ 4300 после чего путем отрицательного десятичного логарифмирования уровень светопропускания трансформировали в светопоглощение, которое выражалось в единицах оптической плотности. Оптическая плотность вычислялась по формуле

О.П. = Lg Ui/100.

Количество ДНК в ядрах определяли после реакции Фёльгена в световом микроскопе Биолам-70 с помощью фотометрирования с применением микронасадки ФМЭЛ-1 и фотометра ФЭУ-79А в проходящем свете с запирающим светофильтром с максимумом светопропускания на длине волны 570 нм с подаваемым напряжением 900 В. Полученные результаты подвергали обратному десятичному логарифмированию по формуле: А=Lg Ui/U0, где A – оптическая плотность, Ui – показания вольтметра на ядре; U0 - показания вольтметра на неокрашенных участках препарата. Диплоидным эталоном служили лимфоциты периферической крови и малые лимфоциты лимфатических узлов.

Для выявления в ткани печени гистамина (ГСТ) был применен люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста (7). Для количественной оценки в гепатоцитах ГСТ использовали метод цитоспектрофлуориметрии: насадкой на люминесцентный микроскоп ФМЭЛ-1А, на вольтметре при напряжении 800 В с зондом 0,5. определяли уровень ГСТ помощью интерференционного фильтра №7 с длиной волны 515 нм. Показания снимали с измерительной части вольтметра в условных единицах флуоресценции.

Пролиферативные процессы в печени оценивали подсчитывая митозы, двуядерные и многоядрышковые гепатоциты на 7000 ядер при увеличении 90х10. В этих же полях зрения считали клетки с дистрофическими изменениями. Электронную микроскопию выполняли на 7-е и 11-е сутки после нанесения травмы (по 3 животных каждой группы на срок 5 суток). Ультратонкие срезы, получали на ультратоме LKB-8800 и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Просмотр препаратов производили на электронном микроскопе УЭМВ-100.

Для иммуногистохимии были использованы два коммерческих моноклональных антитела фирмы Santa Cruze: 1)маркер пролиферативной активности Ki-67; 2) маркер апоптоза всl-2. Иммуногистохимическое исследование проводилось согласно стандартному протоколу. Срезы толщиной 3 мкм окрашивали ручным и аппаратным способами, с использованием иммуногистохимических контейнеров AUTOSTAINER-360 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия) с использованием систем визуализации En-vision (DACO. Дания) и NovoLinc polimer (NovoCastra, Великобритания). Контролем чувствительности и специфичности реакции служили неиммунизированные кроличьи и мышиные сыворотки, а также срезы контрольных тканей печени. Результаты реакций оценивали подсчетом окрашенных ядер на 200 ядер гепатоцитов в шести полях зрения, после чего вычисляли отношение окрашенных гепатоцитов к общему количеству гепатоцитов и выражали полученные результаты в процентах.

Гематологические и биохимические методики касались определения гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов крови; скорость оседания эритроцитов (СОЭ) устанавливалась методом Вестергена. Общий белок в сыворотке крови определяли рефрактометром ИРФ-22, общий кальций – комплексометрическим методом по Уилкинсону. Определение в сыворотке крови активности лактатдегидрогеназы – ЛДГ, аланинаминотрансферазы – АлАт, аспартатаминотрансферазы – АсАт осуществляли с помощью анализатора BS 3000ии (у. е.).

Статистическая обработка цифровых данных производилась по специальной программе «Статистика» с привлечением пакета программ Microsoft office (Word и Excel) на компьютере Pentium 166 MMX. Статистическую достоверность определяли критерием Стьюдента (t).

Результаты исследования и их обсуждение.

В первые сутки после травмы и у опытных, и у контрольных крысят в гистологических препаратах имели место однотипные изменения: в зоне повреждения отмечался щелевидный стереотипный участок дефекта печеночной ткани, заполненный некротизированными печеночными клетками и эритроцитами (Рисунок 1).


На 3-и сутки после повреждения вокруг зоны повреждения возникает реактивно-воспалительная реакция в виде появления клеточного инфильтрата, который прослеживается до 7-х – 9-х суток. У опытных животных количество клеток в инфильтрате небольшое в отличие от контрольных животных, у которых имеет место значительная инфильтрация зоны повреждения молодыми мезенхимальными клетками (Рисунок 2а, б).



По мере заживления повреждения у опытных крысят происходит постепенное уменьшение площади травмированного участка; фибробласты среди клеток инфильтрата появляются лишь на 7-9-е сутки, а развитие соединительной ткани на месте погибшей ткани печени происходит на 11-е сутки после операции. У контрольных крысят визуально существенного уменьшения площади травмированного участка не отмечается; фибробласты появляются среди клеток инфильтрата на 5-7-е сутки, замещение участка дефекта печени соединительной тканью происходит на 9-е сутки после операции.

В итоге и у опытных, и у контрольных животных на месте повреждения обнаруживался участок грубоволокнистой соединительной ткани (Рисунок 2 в,г), однако у первых размеры этого участка были во много раз меньше, чем у контрольных животных.

После нанесения повреждения и вблизи, и в удалении от очага повреждения обнаруживались гепатоциты с дистрофическими и некробиотическими изменениями. Подсчет показал, что таких клеток у опытных крысят было статистически достоверно меньше, чем в печени контрольных животных.

Практически сразу после нанесения механической травмы у животных возникала активация митотического деления гепатоцитов.

Подсчет митотически делящихся клеток показал, что у опытных крысят митозы отмечались уже в 1-е сутки после операции. В контроле первые митозы появлялись только на 3-и сутки. В опыте количество митозов было статистически достоверно (р<0,001) больше, чем у контрольных животных. У опытных животных митозы прослеживались до 15-х суток, у контрольных крысят они переставали прослеживаться на 9-е сутки после травмы.


Кроме митозов у опытных животных по сравнении с контролем отмечалось статистически достоверное (р<0,001) увеличение двуядерных и двуядрышковых гепатоцитов начиная с 7-х суток после операции, которое продолжалось до конца эксперимента (Рисунок 4б).

Процесс заживления механической травмы сопровождался изменением плоидности гепатоцитов за счет увеличения числа тетраплоидных клеток. Если в первые сутки у опытных крысят преобладали диплоидные ядра, то начиная с 3-х суток и до конца эксперимента превалировали тетраплоидные ядра. Это отмечалось и у контрольных крысят, но у опытных оно носило более выраженный характер. Кроме того, у последних определялись гепатоциты и большей плоидности (8п, 16п и даже 32п).

Иммуногистохимическое исследования ядер выявило статистически достоверное увеличение окрашенных маркером пролиферации ядер гепатоцитов (Ki-67) в опыте по сравнению с контрольными животными (Рисунок 6).


Наибольшее число окрашенных ядер приходится на сроки 3,5 и 9 суток после операции (р<0,001).

При заживлении механической травмы печени у опытных крысят в условиях воздействия биологически активных веществ, по сравнению с контрольными животными, происходила активация ряда ферментов (СДГ, MADH, NADFH).

Электронно-микроскопическое исследование, выполненное у опытных крысят, выявило два типа изменений в гепатоцитах. Встречались гепатоциты с явными признаками дегенеративных изменений. В этих клетках имело место набухание митохондрий, очаговое просветление матрикса, нарушение ориентации крист; в ряде митохондрий отмечалось явно сниженное число крист. Канальцы эндоплазматического ретикулума были расширены. Характерным было наличие дезорганизации мембран органелл.

Вместе с тем в электронограммах часто встречались гепатоциты с признаками, которые можно было расценить как проявления внутриклеточной регенерации. В этих клетках имело место набухание и гипертрофия митохондрий, сближение мембран эндоплазматического ретикулума, гиперплазия и гипертрофия рибосом.

Гематологическое исследование выявило значительное улучшение показателей крови у опытных животных. В частности, имело место значительное повышение у них в крови содержания эритроцитов, гемоглобина и общего белка в сыворотке крови.

В ходе заживления травмы печени у крысят отмечено значительное увеличение гистамина у опытных животных по сравнению с контролем. Оно начиналась с первых суток после операции и продолжалось до конца эксперимента. У контрольных животных достоверного увеличения содержания гистамина в гепатоцитах не происходило.

Заключение.

В результате проведенной работы установлено, что сочетанное применение биологически активных препаратов «Трепел» и «Сувар» препятствует в сохранившихся гепатоцитах развитию альтеративных изменений, подавляет клеточно-воспалительную реакцию, возникающую вокруг зоны некроза, препятствуют рекрутированию фибробластов в зону травмы и, таким образом, замедляет коллагенообразование на месте погибшей ткани органа. Показано, что эти препараты оказывают стимулирующий эффект, проявляющийся активацией митотического деления и образованием повышенного числа двуядерных и двуядрышковых гепатоцитов. При этом происходит активация ферментной и белок синтетической функции гепатоцитов. Все вышесказанное приводит к тому, что у крысят в раннем онтогенезе площадь участка соединительной ткани, возникающей на месте погибшей ткани печени у плодов крысят меньше (в среднем на 34,8%) чем у одновозрастных животных контрольной группы. Таким образом, результаты работы устанавливают, что иологически активные вещества «Трепел» и «Сувар» способствуют заживлению механической травмы печени у крыс в раннем онтогенезе.

Список литературы

1.     Архипова, М.Н. Становление и развитие функциональных систем у боровков в биогеохимических условиях Чувашского центра с назначением биогенных соединений: дис. … докт. биол. наук / М. Н. Архипова. – Чебоксары, 2008. – 200 с.

2.     Григорьев С.Г. Становление и развитие морофофизиологического состояния продуктивных животных в биогеохимических условиях Чувашской Рeспублики. Автореф. дис…докт.биол.наук. / С.Г. Григорьев.- Чебоксары,2009.-20с.

3.     Заживихина, Е.И. Влияние препарата «Сувар» на обменные процессы и продуктивность свиней и птиц. Автореф. дис. … канд. биол. наук: / Е.И. Заживихина. – Казань, 1998. – 23 с.

4.     Ллойда, З. Гистохимия ферментов / З. Лойда, Р. Госсрау, Т. Шиблер // Лабораторные методы. – М.: Мир,1982. – 272с.

5.     Меркулова Г.А. Курс патогистологической техники. М.Мед.- 1969.- 423с.

6.     Мохаммед, З. Изучение влияние целитосодержащего трепела на биаминосодержащие структуры тимуса, а также на иммунобиохимические и гематологические параметры крови / З. Мохаммед // Изучение и применение трепелов диатомитов. – Чебоксары, 2000. – С. 44– 60.

7.     Cross C.A. A study methods avaliable for cytochemical localisation of histamine byfluorescence induced with O- phtandehude or aceldehyde / Cross C.A., Even S.W., Rost F.W.// Histochem.J., 1971. – V. 3, №3. – P. 471 – 476.

8.     Michalopoulos, G.K. Liver regeneration / G.K. Michalopoulos, M.C. De Frances// Science. – 1997 – Vol.276. – P. 60–65.