РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ СУММЫ ФУРОКУМАРИНОВ В МЯГКОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ С АНМАРИНОМ

Антимикотик растительного происхождения, анмарин, представляет собой смесь двух изомеров ангидромармезина, производных псоралена (ангидромармезина-5'-изопропенил-4;5'-дигидропсоралена и 5'- изопропилпсоралена). Источником его получения служат семена амми большой (Ammi majus L.) семейства Umbelliferae. Препарат разработан в 90-е годы прошлого века в ВИЛАР. Он обладает выраженными противогрибковыми и фотосенсибилизирующими свойствами [1]. Наряду с псораленом и его производными он может применяться в терапии множества кожных заболеваний [2].

Впервые фурокумарины из плодов амми большой были получены и охарактеризованы в середине прошлого века [3]. Содержание суммы фурокумаринов в плодах Ammi majus может достигать 2,2%. Из лекарственного растительного сырья (ЛРС) амми выделено и охарактеризовано более 20 фуранокумаринов: псорален (около 1%), ксантоксин (0.5%), императорин (0,3%), бергаптен (0,04%), мармезин и его глюкозид мармезинин, изопимпенеллин, изоимператорин, аллоимператорин, аммирин [4, 5], изоарнотинин и его гликозиды [6]. Найдены также 6-гидрокси-7-метокси-4 метил кумарин и 6-гидрокси-7-метокси кумарин [7], обладающие противовоспалительными свойствами.

В эксперименте на животных выявлены антигиперлипидемические, анальгетические и антипиретические свойства кумаринов, содержащихся в этанольном экстракте семян Ammi majus [8].

Анмарин проявляет наряду с фотосенсибилизирующим действием выраженную антифунгальную активность в отношении грибковых поражений кожи и слизистых, обусловленных Trichophvton rubrum, T. interdigitale, T. mentagrophytes var. gypseum, Microsporum canis, Candida albicans и умеренным бактериостатическим действием в отношении грамположительных бактерий. Оказывает кератолитическое, эпителизирующее и стимулирующее рост волос действие. Это обусловило его применение в виде различных лекарственных форм для наружного применения в качестве антимикотического средства для лечения дерматофитий (руброфития, микроспория, трихофития, отрубевидный лишай), поверхностных форм кандидоза кожи, ногтей и слизистой гениталий, себореи волосистой части головы, псориаза и очаговой алопеции [9, 10, 11]. Анмарин по параметрам токсичности относится к малотоксическим веществам; он не обладает кумулятивным свойством, не проявляет аллергизирующих, мутагенных, эмбриотоксических и тератогенных свойств [12].

Количественное определение действующих веществ в субстанциях и лекарственных средствах, содержащих фуранокумарины, проводится хроматографическими (ВЭЖХ и ГЖХ) и спектральными методами [13-15].

Цель исследования является разработка методики количественного определения суммы фурокумаринов, содержащихся в мягкой лекарственной форме (МЛФ) антимикотического действия с 1% содержанием анмарина, состав которой предложен сотрудниками отдела фармацевтической технологии ФГБНУ ВИЛАР.

Материалы и методы. Количественную оценку содержания фурокумаринов осуществляли методом спектрофотометрии. Анализ проводили на спектрофотометре Cary 100 Scan (Varian, США). Испытуемые растворы помещали в кюветы с толщиной слоя 10 мм. В качестве стандартного образца (СО) использовали мармезин, предоставленный отделом фитохимии ВИЛАР.

Результаты и обсуждение.

Для установления рабочей длины волны, оптимальной для решения аналитической задачи, получены спектры поглощения спиртовых извлечений из МЛФ и СО мармезина, имеющие совпадающие максимумы при длине волны 335±1 нм, который отсутствует на спектре извлечения из плацебо. Это определило выбор длины волны 335±1 нм в качестве аналитической (Рисунок 1). Определен удельный показатель поглощения мармезина в 70% спирте, который составил 669.

Около 2 г (точная навеска) МЛФ помещают в стеклянный стаканчик вместимостью 100 мл, прибавляют 40 мл спирта этилового 70% и перемешивают в течение 10 мин. Затем фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл, промывают фильтр 5 мл спирта 70% в ту же колбу, доводят до метки спиртом 70% и перемешивают (Раствор А).

1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки спиртом 70% и перемешивают.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 335±1 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 70% этиловый спирт.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО мармезина. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают около 0,002 г (точная навеска) СО мармезина, доводят 70% спиртом этиловым объем раствора до метки и перемешивают. 2 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят 70% спиртом этиловым объем раствора до метки и перемешивают.

Содержание суммы кумаринов в пересчете на мармезин в исследуемом образце МЛФ составляет не менее 0,85%.

Для экспериментального подтверждения соответствия методики количественного определения суммы фурокумаринов в пересчете на мармезин в МЛФ требованиям нормативной документации, проведена валидация по показателям правильности, сходимости, воспроизводимости, специфичности, линейности (у=70,821х±0,0001, R2=0,9989).

Относительная погрешность среднего результата разработанной методики, установленная на предоставленном образце МЛФ, не превышает ±3,9%.

Контроль правильности (точности) методики (диапазон процента восстановления находится от 97,27% до 100,64% и имеет среднее значение 99,20%). Контроль внутрилабораторной прецизионности методики: сходимость методики (коэффициент относительного стандартного отклонения 1,03%); воспроизводимость (коэффициент относительного стандартного отклонения внутрилабораторной воспроизводимости 2,8%), что указывает на приемлемую прецизионность.

Предел обнаружения найден экспериментально. Самое низкое содержание (концентрация) аналита, которое может быть определено с заданной погрешностью (Табл.1), и при котором аналитическое определение можно более-менее надежно дифференцировать от влияния второстепенных примесей составляет 0,001 мг/мл.

Таким образом, разработана методика количественной оценки суммы фурокумаринов в МЛФ. Валидационная оценка методики анализа позволяет оценить ее положительно по параметрам: правильность, прецизионность, сходимость, воспроизводимость, линейность, специфичность, т.е. подтверждает их пригодность для достоверной оценки качества МЛФ с анманрином и для включения в проект нормативной документации.

Список литературы

1.     Крутов П.В., Громакова А.И. Совершенствование технологии получения лекарственной субстанции противогрибкового действия. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2014.- № 12. - С. 25-27.

2.     Psoralen photobiology and photochemotherapy: 50 years of science and medicine. Bethea D., Fullmer B., Syed S., Seltzer G., Tiano J., Rischko C., Gillespie L., Brown D., Gasparro F.P.A. // J. Dermatol Sci. – 1999.- Vol.19.- N.2.- p.78-88.

3.     A crystalline principle from Ammi majus. / Fahmy I.R., Abu-Shady H., Schönberg A., Sina A. //Nature (London, United Kingdom) .- 1947.- Vol. 160.- p. 468-469.

4.     Ekiert H. I. Ammi majus L. (Bishop’s Weed) in vitro culture and the production of coumarine compounds. In : Biotehnology in Agriculture and Forestry 21. Medicinal and Aromatic Plants IV. Edited by Bajaj Y. P. S. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Springer Science & Business Media.- 1993.- p.2-16

5.     Bartnik M., Mazurek A.K. Isolation of Methoxyfuranocoumarins From Ammi majus by Centrifugal Partition Chromatography. // J. Chromatogr Sci. – 2016.- vol. 54.- N 1.- s.10-16.

6.     Coumarins and coumarin glucosides from the fruits of Ammi majus // Elgamal M.H.A., Shalaby N.M.M., Duddeck H., Hiegemann M. // Phytochemistry. - 1993.- Vol. 34.- N 3.- p. 819-823.

7.     Selim Y.A., Ouf N.H. Anti-inflammatory new coumarin from the Ammi majus L. // Org. Med. Chem. Lett. - 2012.- 2(1):1. http://www.orgmedchemlett.com/content/2/1/1

8.     Evaluation of the antihyperlipidemic, anti-inflammatory, analgesic, and antipyretic activities of ethanolic extract of Ammi majus seeds in albino rats and mice. /Koriem K.M., Asaad G.F., Megahed H.A., Zahran H., Arbid M.S. //Int. J. Toxicol.- 2012.- Vol.31.- N3.- p.294-300.

9.     Фатеева Т.В. Экспериментальные исследования в опытах in vitro отечественного противогрибкового препарата Анмарин из Ammi majus L. // От растения к препарату: традиции и современность: тезисы докл. Всерос. конф. с междун. участием (Москва, 23–24 апр. 2014 г.). – М.- 2014. - c.281–284/;

10. Анализ рынка современных противогрибковых средств растительного происхождения / Сокольская Т.А., Лякина М.Н., Баландина И.А., Джавахян М.А., Николаева О.Б.// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2009. - № 4. - С.8-10.

11. Изучение возможности использования плодов амми большой для получения лекарственных субстанций фотосенсибилизирующего и противогрибкового действия / П. В. Крутов, А. И. Громакова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2014. - № 12. - С. 21-24.

12. Доклиническое изучение безопасности антимикотического лекарственного средства анмарина / Бортникова В.В., Крепкова Л.В., Арзамасцев Е.В., Шкаренков А.А. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2006. - № 3. - c. 32-36.

13. Разработка методики количественного определения суммы фурокумаринов в плодах амми большой методом ВЭЖХ. / Николаева О.Б., Шемерянкина Т.Б., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.- 2010.- № 10.- с. 30-34.

14. Генкина Г.А. Методы анализа фурокумаринов // Хим. фарм. журн.-.1981.- т.15. - N11. - c. 108-115

15. Balbaa S.I., Hilal S.H., Haggag M.Y. A spectrophotometric method for the estimation of furocoumarin content of the fruits of Ammi majus. // Planta Med. – 1972. - Vol.22.- N2.- p.209-212.