ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ L-МЕТИОНИН–γ-ЛИАЗЫ ИЗ C. SPOROGENES НА МОДЕЛИ МЕЛАНОМЫ B16 МЫШЕЙ

Применение ферментных препаратов, необратимо разрушающих определенные аминокислоты, в онкологии, основано на метаболической специфичности некоторых опухолевых клеток, характерной особенностью которых является отсутствие или низкая активность синтетаз определенных аминокислот [1, 2]. Среди представителей этого класса наиболее известна L-аспарагиназа E. coli, которая применяется для лечения острых лимфобластных лейкозов уже более 30 лет [3-5]. В последние годы выделены и изучены L- аспарагиназы из различных источников [6-8], L-лизин-альфа-оксидаза Trichoderma cf. aureoviride Rifai [9], L-фенилаланин-аммиак-лиаза [10], L-аргининдезиминаза [11] и др.

Метионин–γ-лиаза — пиридоксаль-5’-фосфат-зависимый фермент (МГЛ, КФ 4.4.1.11), катализирующий реакцию γ-элиминирования  L-метионина с образованием метилмеркаптана, α- кетомасляной кислоты и аммиака. Ранее были определены параметры стационарной кинетики МГЛ Clostridium sporogenes в реакции γ-элиминирования L-метионина, а также установлена ее четвертичная структура [12]. При изучении фармакокинетики МГЛ C. sporogenes у мышей показано, что после однократного введения 500 Ед/кг AUC0-inf составила 13,88±0,39 Ед/(мл×ч), а клиренс МГЛ C. sporogenes был лучше, чем у ближайших аналогов — МГЛ из C. tetani и C. freundii [13].

Цель исследования: определить противоопухолевую активность МГЛ из C. sporogenes на перевиваемой меланомы В16 мышей при внутрибрюшинном и внутривенном путях введения.

Материалы и методы

Животные. В опытах использовали мышей-самок BDF1 массой не менее 18 г, которых содержали в виварии при естественном освещении на брикетированном корме и постоянном доступе к воде. Перед лечением мышей распределяли на группы (n=8–10). Одну группу оставляли без лечения и считали контрольной (n=10).

Модель опухоли. Штамм меланомы B16 получен из Банка опухолевых штаммов РОНЦ, в опытах использованы 4 пассажа in vivo. Опухоль трансплантировали мышам по стандартной методике подкожно [14, 15].

Препараты вводили внутрибрюшинно (в/б) или внутривенно (в/в). Использовали готовую лекарственную форму МГЛ (получена и выделена в ФГБУ «ГосНИИгенетика»), лиофилизированная, а также пиридоксин (Виал, Россия, 50 мг/мл). Лечение начинали через 48 ч после трансплантации опухоли. МГЛ вводили в/в или в/б 20-кратно в дозах 500, 1000 и 2000 Е/кг с интервалом 12 ч. Пиридоксин вводили в/б в дозе 300 мг/кг в аналогичном режиме, одновременно с МГЛ. Непосредственно перед введением препараты вводили в изотоническом растворе натрия хлорида.

Оценка противоопухолевого эффекта. Эффективность лечения оценивали по торможению роста опухоли (ТРО%). Значимым считали ТРО≥50% [14, 15].

Оценка переносимости лечения. О токсическом действии препаратов судили по состоянию и поведению животных, достоверному уменьшению массы тела (≥30%) и селезенки (косвенные признаки общей и гематологической токсичности).

Статистическая обработка. Статистическую обработку проводили путем двухфакторного дисперсионного анализа. Достоверными считали различия при p <0,05.

Результаты

На 10-е сутки после трансплантации наблюдался достоверный значимый противоопухолевый эффект: ТРО 59% в группе 2000 Е/кг в/б, 53% в группе МГЛ 1000 Е/кг в/б + пиридоксин и 50% в группе 500 Е/кг в/в + пиридоксин (табл. 1). Различия между группами МГЛ 1000 Е/кг в/б + пиридоксин и МГЛ 1000 Е/кг в/б; а также МГЛ 500 Е/кг в/в + пиридоксин и МГЛ 500 Е/кг в/в были статистически достоверными (p<0,05), что говорит о повышении противоопухолевой активности МГЛ в присутствии пиридоксина.

Таблица 1. Размеры опухоли на 10-е сутки после трансплантации

На 14-й день после трансплантации (3 сутки после окончания лечения) наблюдаемый противоопухолевый эффект был менее выраженным, но в некоторых группах также достигал достоверных значений: 35% в группе 2000 Е/кг в/б, 45% в группе МГЛ 1000 Е/кг в/б + пиридоксин (табл. 2).

Таблица 2. Размеры опухоли на 14-е сутки после трансплантации

По прошествии 18  суток после трансплантации (7 суток  после  окончания лечения) отличия в размерах опухолей контрольной и экспериментальных групп не достигали достоверных значений.

Переносимость всех видов лечения была удовлетворительной. Поведение мышей без особенностей, однако у всех животных на протяжении недели после лечения отмечали умеренную диарею без существенной потери массы тела (≤20%).

Заключение

Модель опухоли меланомы В16 мышей обладает чувствительностью к МГЛ из C. sporogenes. Противоопухолевый эффект возрастает с повышением лекарственной дозы в пределах изученных схем лечения. Пиридоксин достоверно повышает противоопухолевый эффект МГЛ из C. sporogenes в отношении изученной опухолевой модели.

Изученная готовая лекарственная форма МГЛ может быть рекомендована для дальнейшего изучения в качестве противоопухолевого агента с целью выявления других чувствительных опухолевых моделей, а также диапазона эффективных и переносимых доз.

Список литературы

1. Покровский В.С., Лесная Н.А., Трещалина Е.М., Лукашева Е.В., Березов Т.Т. Перспективы разработки новых ферментных противоопухолевых препаратов / Вопросы онкологии. 2011. Т. 57. № 2. С. 155-164.

2. Покровский В.С., Трещалина Е.М. Ферментные препараты в онкогематологии: актуальные направления экспериментальных исследований и перспективы клинического применения / Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2014. Т. 7. № 1. С. 28-38.

3. Egler RA, Ahuja SP, Matloub Y. L-asparaginase in the treatment of patients with acute lymphoblastic leukemia / J Pharmacol Pharmacother. 2016. Vol. 7(2). P. 62-71.

4. Pokrovskaya M.V., Aleksandrova S.S., Pokrovsky V.S. et al. Identification of functional regions in the Rhodospirillum rubrum L-asparaginase by site-directed mutagenesis / Molecular Biotechnology. 2015. Т. 57. № 3. С. 251-264.

5. Pokrovsky V.S., Pokrovskaya M.V., Aleksandrova S.S., Kazanov M.D., Dyakov I.N. Comparative immunogenicity and structural analysis of epitopes of different bacterial L-asparaginases / BMC Cancer. 2016. Т. 16. № 1. С. 89.

6. Sannikova E.P., Bulushova N.V., Cheperegin S.E. et al. The modified heparin-binding L-asparaginase of Wolinella succinogenes / Molecular Biotechnology. 2016. Т. 58. № 8-9. С. 528-539.

7. Покровский В.С., Покровская М.В., Александрова С.С. и др. Физико-химические свойства и антипролиферативная активность рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis / Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т. 49. № 1. С. 24.

8. Pokrovskaya M.V., Pokrovskiy V.S., Aleksandrova S.S. et al. Recombinant intracellular Rhodospirillum rubrum L-asparaginase with low L-glutaminase activity and antiproliferative effect / Biochemistry (Moscow) Supplement. Series B: Biomedical Chemistry. 2012. Т. 6. № 2. С. 123-131.

9. Pokrovsky V.S., Treshalina H.M., Sedakova L.A., Lukasheva E.V., Berezov T.T., Medentzev A.G., Arinbasarova A.Y. Enzymatic properties and anticancer activity of l-lysine α-oxidase from Trichoderma cf. aureoviride rifai BKMF-4268D / Anti-Cancer Drugs. 2013. Т. 24. № 8. С. 846-851.

10.   Babich O.O., Prosekov A.Y., Pokrovsky V.S., Sokolov N.N., Anisimova N.Y. Recombinant L- phenylalanine ammonia lyase from Rhodosporidium toruloides as a potential anticancer agent / Biotechnology and Applied Biochemistry. 2013. Т. 60. № 3. С. 316-322.

11.   Han RZ, Xu GC, Dong JJ, Ni Y. Arginine deiminase: recent advances in discovery, crystal structure, and protein engineering for improved properties as an anti-tumor drug /Appl Microbiol Biotechnol. 2016 Vol. 100(11) P. 4747-60.

12.   Морозова Е.А., Куликова В.В., Яшин Д.В. и др. Кинетические характеристики и цитотоксическая активность рекомбинантных препаратов метионин–γ-лиазы Сlostridium tetani, Clostridium sporogenes, Porphyromonas gingivalis и Citrobacter freundii / Acta Naturae. 2013. Т. 5. № 3 (18). С. 96-102.

13.   Morozova E.A., Anufrieva N.V., Davydov D.Z. et al. Plasma methionine depletion and pharmacokinetic properties in mice of methionine γ-lyase from Citrobacter freundii, Clostridium tetani and Clostridium sporogenes / Biomed Pharmacother. 2017 Vol 88. P. 978-984. doi: 10.1016/j.biopha.2017.01.127

14.   Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические указания по изучению противоопухолевой  активности  фармакологических  веществ.  —  В  кн.:  Руководство  по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ // Под общей ред. Р.У. Хабриева. — 2 изд. — М. — Медицина. — 2005 г. — С. 637–651.

15.   Chabner B.A., Longo D.L. Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice. — 3rd ed.,Philadelphia: Lippincott-Raven, 2001. — P. 678–699.