08 мая 2016г.
Доказано, что с возрастом проявляются выраженные сдвиги в структуре и регуляторных механизмах гемостаза [2, 9]. После 40 лет происходит сдвиг баланса гемостаза в сторону увеличения прокоагулянтной активности крови и увеличение интенсивности внутрисосудистого тромбообразования [7,8,10]. В ответ на перестройку в системе прокоагулянтного гемостаза активируется фибринолиз [9]. Ферментом, разрушающим фибрин, является плазмин, синтезируемый в основном в печени в виде профермента плазминогена. Активация плазминогена осуществляется при участии тканевых активаторов, к которым относится t-PA. Он секретируется главным образом из эндотелиоцитов [1]. В плазме находятся и ингибиторы фибринолиза. Важнейший из них это ингибитор первого типа (PAI-1), ему принадлежит основная роль в торможении начальных стадий фибринолиза, и который нередко называют эндотелиальным. Вместе с тем он синтезируется не только эндотелием, но и моноцитами, макрофагами и др. клетками [3, 11]. Имеются данные, что с возрастом плазменный уровень PAI-1 растет и это может способствовать сдвигу баланса в сторону коагуляционных процессов [4]. В регуляции гемостаза принимают участие природные и синтетические пептиды. В экспериментах на животных и при клинических исследованиях на пациентах с заболеваниями, сопровождающимися гиперкоагуляцией и угнетением фибринолиза, было показано, что пептиды лиз-глу и ала-глу-асп-глу оказывают существенное влияние на состояние системы гемостаза и фибринолитическую активность крови [3, 5]. Между тем, в ранее проводимых опытах in vitro не установлено их воздействие на указанные параметры. Изучение же пептидергической регуляции гемостаза помогло бы в познании механизмов, контролируемых данными пептидами и разработке способов коррекции физиологических функций организма. В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилась оценка влияния пептидов вилона и эпиталона в зависимости от возраста на показатели гемостаза in vitro.
Материалы и методы: В исследовании принимали участие 15 относительно здоровых, некурящих добровольцев мужчин (каждый из них дал свое информированное согласие). Участники были поделенных на три группы (по пять человек в каждой) в зависимости от возраста: первая группа – от 24 до 30 лет, вторая – от 35 до 40 лет, и третья – от 44 до 50 лет. У каждого забирали кровь из локтевой вены в пробирки с добавлением антикоагулянта – гепарина Li. По 1 мл крови каждого обследуемого помещали в стерильные пластиковые пробирки, в две из которых добавляли растворы либо вилона, либо эпиталона в концентрации 5 нг/мл. Контролем являлись аликвоты крови, инкубированные без добавления пептидов. После 4х часов инкубации при 370С в 4,8% СО2 кровь центрифугировали. В плазме не инкубированной крови, и в плазме после инкубации осуществляли оценку концентрации тканевой активатора плазминогена (t-PA) и ингибитора активатора (раi) методом ИФА с помощью наборов реактивов (Technozym, Германия). Анализ полученных результатов проводили с помощью программы Statistica 6.1 (StatSoft). Описательная статистика представлена медианой и межквартильным интервалом (25-го; 75-го перцентилей); сравнение зависимых выборок проводили с помощью критерия Вилкоксона. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался р<0,05.
Результаты и обсуждение. Концентрации факторов фибринолиза в плазме крови, выявленные после четырехчасовой инкубации в контрольной пробирке, не значительно отличались от таковых полученных до инкубации. Сравнительный анализ результатов в зависимости от возраста показал, что у обследуемых старше 44 лет концентрация тканевого активатора плазминогена на 38,0% (р=0.003) была выше, чем в группе лиц молодого возраста. Однако значения ингибитора активатора тоже были выше – на 75,1% (р=0.006) чем у лиц молодого возраста, и на 93,5% (р=0.001) – чем у лиц среднего возраста, что вполне согласуется с литературными данными. Соответственно соотношение Раi/t-PA, позволяющее оценить сдвиг в процессах прокоагулянтной активности крови и фибринолиза в старшей группе было максимальным и превышало таковые как в группе лиц молодого возраста на 26,8% (р=0.01), так и в группе лиц среднего – на 65,1% (р=0,001)
После четырехчасовой инкубации крови с пептидами результаты выглядели следующим образом. Под действием вилона и эпиталона в крови лиц 1 группы увеличилась концентрация t-PA на 85,0% (р=0.001) и 52,4% (р=0.02), а также концентрация Раi на 65,4% (р=0.005) и на 63,8% (р=0.003) соответственно. При этом соотношение Раi/t-PA практически не изменилось.
В крови лиц второй группы при инкубации с вилоном и эпиталоном возрос уровень тканевого активатора плазминогена на 226,1% (р=0.001) и на 63,9% (р=0.049) соответственно. Уровень ингибитора активатора увеличился лишь под действием вилона на 51,7% (р=0.009). Но при этом соотношение Раi/t-PA уменьшилось под действием обоих пептидов: на 53,9% (р=0.001) при инкубации с вилоном, и на 18,8% (р=0.045) при инкубации с эпиталоном.
В крови группы лиц более старшего возраста лишь инкубация с эпиталоном привела к существенному увеличению концентрации тканевого активатора плазминогена – на 116,3 % (р=0.001) по сравнению с контролем. Между тем, соотношение Раi/t-PA под действием пептидов снизилось – на 14,9% (р=0.042) при инкубации с вилоном, и на 56,8% (р=0.001) при инкубации с эпиталоном относительно контроля.
На наш взгляд, полученные данные свидетельствуют о наличии прямого воздействия изучаемых пептидов на показатели гемостаза, что возможно благодаря наличию определенных сайтов связывания в промоторных участках гена t-PA и Раi для вилона и эпиталона [3], последние действуя на данные участки стимулируют их экспрессию, как в циркулирующих эндотелиоцитах, так и для Раi в клетках крови. Различия в силе эффектов пептидов в группах разных возрастов могут быть обусловлены либо различием в количестве клеток, способных продуцировать данные факторы гемостаза (имеются данные о том, что с возрастом количество циркулирующих эндотелиоцитов снижается [6]), либо в их активности.
Выводы: в in vitro исследовании пептиды вилон и эпиталон вызывают изменение концентраций тканевого активатора плазминогена (t-PA) и ингибитора активатора (Раi-1). Соотношение Раi/t-PA под воздействием пептидов, в большей степени изменяется у лиц в возрасте от 44 до 50 лет.
Список литературы
1. Айсина Р.Б. Структура и функции системы плазминоген – плазмин / Р.Б. Айсина, Л.И. Мухаметова // Биоорганическая химия. 2014. № 6. .642-657.
2. Захарова Н.О. Возрастные особенности агрегатного состояния крови у лиц старческого возраста при физиологическом старении / Н.О. Захарова, А.И. Лысенко // Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24, № 2. - С. 257-262.
3. Кузник Б.И. Эпигенетические механизмы действия дипептида LYS-GLU и тетрапептида ALA-GLU-ASP- GLY на фибринолитическую активность крови / Б.И. Кузник, В.Х. Хавинсон, С.И. Тарновская // Тромбоз, гемостаз и реология. – 2013. – № 4 (56). – С. 40-44.
4. Кузник Б.И. Эпигенетические механизмы действия пептидов LYS-GLU и ALA-GLU-ASP-GLY на систему гемостаза, цитокиновый профиль и продолжительность жизни / Б.И. Кузник, В.Х. Хавинсон, С.И. Тарновская, Н.С. Линькова // Проблемы клинической медицины. – 2014. – № 1-2 (33). – С. 29-42.
5. Лысенко А.И. Оценка агрегационной функции тромбоцитов и ремоделирования микроциркуляторного русла у лиц старческого возраста с ишемической болезнью сердца / А.И. Лысенко, Н.О. Захарова, С.И. Бердяшкина // Клиническая геронтология. - 2011. - № 5-6. - С. 72-75.
6. Моисеева О.М. Исследование циркулирующих эндотелиальных клеток – предшественников у больных с хронической сердечной недостаточностью / О.М. Моисеева, Е.В. Карелкина, В.С.Морошкин // Кардиология 2011. № 12. С.36-42.
7. Amin H. Coagulation factors and antithrombin levels in young and elderly subjects in Pakistani population / Amin H., Mohsin S., Aslam M., et al. // Blood. Coagul. Fibrinolysis. – 2012. – Vоl. 23, № 8. – Р. 745-750.
8. Hittel D.S. Skeletal muscle dictates the fibrinolytic state after exercise training in overweight men with characteristics of metabolic syndrome / W.E Kraus ., E.P Hoffman // J. Physiol. – 2003. – Vоl 548, № 2. – Р. 401- 410.
9. Kruse-Jarres R. Acquired bleeding disorders in the elderly // Hematology. Am. Soc. Hematol. Educ. Program. – 2015. – № 1. – Р. 231-236.
10. Madla W. Fresh frozen plasma quality: relation to age and gender of blood donors/ W. Madla ., Т. Alt, Н. Jungk, J. Bux . // Vox. Sang. 2012.Vоl. 102, № 2. Р. 116-124.
11. Yildiz S.Y., The сomparison of аdipose stem cell and placental stem cell in secretion characteristics and in facial antiaging / P. Kuru, E.T Oner., M.Agirbasli // The Scientific World J. 2014. 2014.858293.
