КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СИНЕРГИЗМА ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ ФЕНОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

Среди большинства природных антиоксидантов наиболее распространенными соединениями, отличающимися высокой структурной полифункциональностью и биологической активностью, являются флавоноиды – один из многочисленных классов обширного семейства растительных фенолов [2,6]. Гликозиды и эфиры полигидроксикислот и флавоноидов еще в большей степени расширяют структурные возможности флавоноидов. Информация о связи биологической активности со структурными особенностями флавоноидов крайне ограничена [6,11,13]. Тем не менее, без представления о пространственной структуре и ориентации функциональных групп в этих соединениях картина не может быть полной.

Цель работы и метод расчета. Целью настоящей работы является установление связи между антирадикальной и антиоксидантной активностью флавоноидов и некоторыми расчетными параметрами их структуры. Множественность возможных взаимодействий флавоноидов с ферментными системами, в том числе ферментами метаболизма активных форм кислорода (АФК), с мембранными структурами, и в первую очередь, с точки зрения гидрофобных взаимодействий, не позволяют рассматривать проблему антиоксидантной активности в полном объеме [6,9]. Однако, такой важный аспект этой проблемы, как функционирование флавоноидов в качестве «ловушек» свободных радикалов [2,3,6,8,9,10,13], в первом приближении может быть рассмотрен с точки зрения термодинамической выгодности процесса переноса электрона и восстановления молекул субстрата окисления.

Нами были проведены квантово-химические расчеты молекулярных структур флавоноидов семейства флавон-3-олов (рис. 1) и других семейств флавоноидов, некоторых природных антиоксидантов фенольной природы, а также субстратов окисления – полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в условиях пренебрежения взаимодействиями с соседними молекулами. Для этого использовали полуэмпирическую параметризацию PM-3 на основе метода МО ЛКАО самосогласованного поля Хартри- Фока (ССП ХФ) [4] с учетом всех валентных электронов, и пренебрежением нулевым дифференциальным перекрыванием.

Результаты и их обсуждение. Известно [8], что одним из ключевых процессов, инициируемых активными формами кислорода в клетке организма, являются процессы перекисного окисления липидов, протекающие по цепному свободно-радикальному механизму. В ходе указанных реакций происходит накопление аллильных L·, пероксильных LOO· и алкоксильных LO· радикалов липидов, инициирующих образование новых радикалов и, тем самым – новых цепей окисления.

Подобно a-токоферолу и другим фенольным соединениям флавоноид, выступающий в качестве ловушки радикалов, способен отдавать свой атом водорода субстрату, например, липиду, окисляясь до флавоноксильного радикала. Действительно, редокс-потенциал флавоноксильных радикалов, как и токоферил-радикалов, ниже потенциала пероксидного радикала липида [7,13]. Однако, указанный перенос электрона является энергетически выгодным не для всех гидроксильных групп молекулы.

Квантово-химический расчет энергии отрыва атома водорода от различных гидроксильных групп флавоноидов показывает, что 3’,4’-OH, и 3-OH (для сопряженных структур) положения отвечают наименьшей величине энергии образования радикала (табл. 1). Однако, с учетом стерического экранирования наиболее выгодными являются 3’,4’-OH положения, что согласуется с экспериментальными данными [13]. Тем не менее, изолированный характер 3’, 4’-OH – групп едва ли имеет место. Так, наличествующая во всех без исключения флавоноидах 7-OH – группа, отличающаяся повышенной склонностью к диссоциации и образованию анионной формы, по-видимому, играет важную роль в стабилизации

флавоноксильного радикала. Свидетельством этому являются полученные в расчетах данные по энергии образования радикала и порядкам связей в молекулах. Наиболее глубокий минимум энергии для радикала кверцетина (E = -185.6 ккал/моль) достигается в случае его анионной структуры - E = -234.4 ккал/моль, что соответствует наибольшей делокализации электронной плотности и увеличению значений порядков связей.

Таблица 1.

Расчетные значения энергий отрыва атома водорода от различных гидроксильных групп молекул флавоноидов

Вообще, фактор стабилизации флавоноксильного радикала играет важную роль в проявлении антирадикальной и антиоксидантной активности флавоноида, которые, как известно [7,10], не всегда совпадают. В таблице 2 приведены расчетные значения энергии образования радикалов в 4’-OH положении для различных флавоноидов.

Таблица 2.

Расчетные значения энергий отрыва атома водорода DE и энергий E образования флавоноксильных радикалов (4’-OH – положение)

Можно полагать, что более стабильные радикальные структуры, соответствующие наиболее глубокому минимуму энергии (например, мерицетин, кверцетин, робинетин, катехин и большая часть флаванонолов), обладают более высокой антиоксидантной активностью в силу меньшей реакционной способности, а значит, неспособности эффективно продолжать цепи окисления [7,10,13]. В целом, проблема антиоксидантной и прооксидантной активности в зависимости от строения и концентрационных соотношений антиоксидантов в реакционных системах сложна, и требует своего решения.

Так, ингибирование процессов перекисного окисления липидов (обычно обозначаемое k7) с помощью известных ловушек радикалов, например, биофлавоноидов или a-токоферола, может быть неэффективным в отсутствие иных соединений-синергистов – восстановителей токоферола. Чтобы предотвратить продолжение цепей свободно-радикального окисления, которую ведут образовавшиеся радикалы самого ингибитора – флавоноксильные или токоферил-радикалы (обозначаемые k10), необходимо совместное действие ступенчато построенной системы антиоксидантов и синергистов, каждая ступень которой выполняет восстанавливающую функцию для предыдущей (рис. 2). Такое совместное действие системы антиоксидантов может характеризоваться соответствующими значениями DE энергии гомолитического отрыва атома водорода от молекул в ходе их окисления

DE = E(Ing·) - E(IngH),                                                            (1)

а также большей устойчивостью последовательно образующихся радикалов ингибиторов по сравнению с субстратом (величины E в табл. 2).

Расчеты показывают, что значения редокс-потенциалов [10,13] флавоноидов одного семейства удовлетворительно коррелируют с величинами DE. Например, для группы флавонолов получена монотонно возрастающая линейная зависимость. Для совокупности флавоноидов из разных групп имеет место монотонно возрастающая зависимость, нелинейный характер которой, очевидно, обусловлен наложением прямых с различным наклоном от каждого из семейств. Таким образом, чем меньше энергия отрыва атома водорода для данного соединения, тем выше его восстанавливающая способность. Полученные данные позволяют упростить процедуру поиска эффективной системы антиоксидантов и синергистов, приведя ее на первом этапе к теоретическому расчету DE, без экспериментального определения значений редокс- потенциалов.

Можно полагать, что для оценки энергетической выгодности протекания окислительно- восстановительного процесса в направлении восстановления субстрата LH, достаточно исходить из сравнения DE(IngH) и DE(L·):

DE(IngH) < DE(L·),                                                              (2)

Условие (2) отражает известный [1] термодинамический критерий преимущественного направления протекания химического процесса. Иными словами, равновесие обратимой реакции будет сдвинуто в сторону восстановленного субстрата, если

(E(Ing·) + E(LH)) - (E(IngH) + E(L·)) < 0.                                               (3)

Приведенный квантово-химический расчет свидетельствует о том, что для биофлавоноидов значения DE варьируют в зависимости от строения от 28 до 39 ккал/моль (табл. 2), что сравнимо с рассчитанной величиной для a-токоферола DE = 29.2 ккал/моль (табл. 3). Это указывает на то, что восстановление токоферола из токоферил-радикала при помощи флавоноидов значительно менее выгодно, чем аскорбиновой кислотой (DE = 10.3 ¸ 13.8 ккал/моль), что согласуется с литературными данными [10,11].

Так, значение редокс-потенциала тролокса (водорастворимого аналога a-токоферола) ниже (а не выше), чем у флавоноксильного радикала [7]. В то же время, сам флавоноид может восстанавливаться из своей окисленной формы также при непосредственном участии аскорбиновой кислоты (рис. 2). Ее восстановительные свойства как антиоксиданта, и, прежде всего, как эффективного синергиста других антиоксидантов (токоферолов, флавоноидов), обусловлены наиболее низким редокс-потенциалом [5,11], и соответственно наименьшим значением DE (табл. 3). Тем самым, она может служить эффективным восстановителем окисленных форм всех антиоксидантов.

Таблица 3.

Расчетные значения энергий отрыва атома водорода DE от молекул субстратов окисления и энергий образования Е радикалов

В таблице 4 представлены значения DE и энергии образования E алкильного, пероксильного и алкоксильного радикалов  для 4 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), входящих в состав фосфолипидов биомембран. Как и следовало ожидать, значения E убывают в зависимости от числа двойных цис-связей в ряду 1-2-3-4 (олеиновая – линолевая – линоленовая – арахидоновая кислота) как для самих молекул субстратов окисления, так и для их радикалов.

Таблица 4.

Расчетные значения энергий отрыва атома водорода DE от молекул некоторых антиоксидантов и энергий образования Е их радикалов

Наиболее вероятное расположение радикального центра в случае алкильного радикала линолевой кислоты показано на рис. 3а и 3б, что соответствует более глубокому минимуму энергии образования радикала (табл. 4), чем состояние 2 (рис. 3в). На основе рассчитанных значений порядков связей можно полагать, что конфигурация 1 (рис. 3б) характеризуется более выраженной делокализацией электронной плотности, отвечающая более устойчивому состоянию радикала L·.

Можно полагать, что в образующемся из L· радикале LOO· пероксильная группа располагается у 11 атома углерода, на котором локализована электронная плотность в алкильном радикале L· (рис. 3б). Однако, расчет показывает, что состояния 1 и 2 (рис. 4а и 4б) пероксильного радикала характеризуются близкими значениями энергии образования E и восстановления DE (табл. 4), а в состоянии 2 имеет место обращение цис-конфигурации в транс-конфигурацию за счет смещения электронной плотности от двойной связи, что соответствует литературным  данным  [5,11]. Таким образом, вероятны внутримолекулярные перегруппировки в состояние 2.

Аналогичное обращение цис-конфигурации в транс-конфигурацию обнаруживается и для алкоксильного радикала (рис. 5а и 5б), образующегося в ходе реакций распада гидроперекисей. Оба возможные состояния радикала LO· также имеют близкие значения E и DE (табл. 3).

Из сравнения величин DE для радикалов LOO·, LO· с соответствующими значениями для антиоксидантов (ингибиторов окисления) – токоферола и ряда флавоноидов (см. табл. 4), можно заключить, что последние могут выступать в роли термодинамически выгодных восстановителей субстратов LOOH, LOH из указанных радикалов, поскольку

DE(a-Toc-OH) < DE(LO·, LOO·) и DE(BF-OH) < DE(LO·, LOO·)                            (4)

В свою очередь, флавоноксильные и токоферил-радикалы в силу термодинамической выгодности могут быть восстановлены в присутствии аскорбиновой кислоты

DE(AK) < DE(a-Toc-O·) и DE(AK) < DE(BF-O·).                                       (5)

Тем самым обрываются возможные цепи свободно-радикального окисления (обычно обозначаемые k10) на радикалах указанных ингибиторов, что наряду с их высокой антирадикальной активностью повышает и антиоксидантную активность всей многоступенчатой системы.

Полученные для состояния 1 (рис. 3б) алкильного радикала значения DE рассмотренных ПНЖК, как видно из таблиц 3 и 4, меньше, чем соответствующие величины для токоферола и всех флавоноидов, но превышают DE аскорбиновой кислоты. Это, очевидно, означает, что прямое восстановление субстрата LH из его алкильного радикала L· термодинамически выгодно только аскорбиновой кислотой (см. схему на рис. 2), тогда как в случае токоферола и флавоноидов равновесие таких реакций сдвинуто в сторону окисления субстратов.

Однако, указанное свойство может служить основой для предположения о механизме экспериментально наблюдаемого in vitro [12] синергизма смесей “токоферол – лецитин” и “флавоноид – лецитин”. Можно полагать, что в присутствии синергиста – лецитина LHsyn равновесие реакции сдвигается в сторону восстановления субстрата LH токоферолом или флавоноидом, поскольку восстановление последних при участии лецитина или ПНЖК термодинамически выгодно (рис. 6):

DE(L·) < DE(a-Toc-OH), DE(BF-OH)                                                 (6)

DE(LHsyn) < DE(a-Toc-O·), DE(BF-O·).                                             (7)

Еще одним из возможных механизмов антирадикальной активности флавоноидов могут служить реакции инактивации радикалов, так называемые реакции “гашения” алкильных радикалов флавоноксильными радикалами:

BF-O·    +   L·   ®  BFO-L                                                    (I)

В результате протекания указанных реакций возможно образование достаточно устойчивых по энергии нерадикальных продуктов BFO-L и рекомбинация сразу двух активных радикалов. На основе расчетов и уравнения

DE’ = E(BFO-L) – [ E(BF-O·) + E(L·)]                                         (8)

получены значения выигрышей энергии DE’ в реакциях (I): более высокие значения DE’ (» 43 ¸  47 ккал/моль) отвечают флавоноидам, имеющих в кольце B одну гидроксильную группу в 4’-положении (кемпферол, дигидрокемпферол, 3,4’,7-тригидроксифлавон, гарбанзол, апигенин, нарингенин и др.), чем две OH-группы в 3’, 4’ положениях, что обусловлено стерическими факторами (рис. 1). Кроме того, радикалы флавоноидов с одной OH-группой в 4’-положении являются наиболее неустойчивыми, а значит, они способны легко вступать в реакции инактивации и «гашения» (I).

Как и следовало ожидать, в ходе гомолитического образования ковалентной связи BFO : L наблюдается иное распределение электронной плотности молекулы продукта BFO-L, чем в отдельных радикалах линолевой кислоты L· (рис. 4б) и кверцетина BF-O·: так, в молекуле продукта оно становится идентичным распределению в нейтральных молекулах линолевой кислоты и кверцетина, поскольку один из вступающих в реакцию (I) радикалов замещает недостающий атом водорода у другого радикала. Тем самым, образующееся нерадикальное соединение становится более устойчивым.

Молекула флавоноида, участвуя как в окислительно-восстановительных реакциях, так и реакциях «гашения»,  способна инактивировать, как  минимум, два липидных  радикала. Таким образом,  реакции «гашения» могут являться дополнительном механизмом к приведенной восстановительной антиоксидантной системе, выводящим активные радикалы из сферы реакций свободно-радикального окисления, и тем самым способствующим повышению антиоксидантной активности системы.

Заключение. Как следует из квантово-химических расчетов, для предотвращения продолжения цепей свободно-радикального окисления, необходимо совместное действие системы антиоксидантов, характеризующихся соответствующими значениями энергий DE восстановления радикалов. Расчеты показывают, что флавоноиды могут функционировать параллельно с a-токоферолом как эффективные ловушки пероксильных и алкоксильных радикалов липидов. Образующиеся в результате флавоноксильные радикалы в ряде случаев могут быть более устойчивыми по сравнению с токоферил-радикалами и не давать продолжения цепей окисления. В то же время, синергизм совместного действия антиоксидантов с участием токоферола или флавоноидов наиболее выгоден в системах с аскорбиновой кислотой, характеризующейся наименьшим значением DE, а также в присутствии дополнительного количества молекул ПНЖК или лецитина. Наличие в антиоксидантной системе последних может также способствовать эффективному антиокислительному действию a-токоферола и флавоноидов и на алкильных радикалах липидов, для которых величина DE меньше соответствующих значений для указанных антиоксидантов. Наряду с восстановительными свойствами флавоноидов термодинамически обоснованным представляется и механизм инактивации алкильных радикалов липидов с флавоноксильными радикалами.

Список литературы

1.        Герасимов Я.И. Курс физической химии. Т. 1. – М.: Химия, 1973. – 656 с.

2.        Дадали В.А. Биохимические основы действия микрокомпонентов пищи / Шабров А.В., Дадали В.А., Макаров В.Г. – М.: 2003. – 174 с.

3.        Дадали Ю.В., Дадали В.А., Макаров В.Г. и др. Сравнительное кинетическое исследование антирадикальной и антиоксидантной активности природных полифенолов в реакциях инициированного окисления N,N'-дифенил-п-фенилендиамина / Дадали Ю.В., Дадали В.А., Макаров В.Г., Кулеба В.А. // Профилактическая и клиническая медицина. – 2014. – Вып. 1 (50). – С. 93 – 99.

4.        Дьячков П.Н.. Квантово-химические расчеты в изучении механизма действия и токсичности чужеродных веществ” - В сб. Итоги науки и техники. – М.: ВИНИТИ, 1990. – 279 с.

5.        Девис М., Остин Дж., Патридж Д.. Витамин С. Химия и биохимия. – М.: Мир, 1999. – 176 с.

6.        Макарова М.Н., Макаров В.Г. Молекулярная биология флавоноидов (химия, биохимия, фармакология): Руководство для врачей. – СПб, 2010. – 428 с.

7.        Надиров Н.К. Токоферолы и их использование в медицине и сельском хозяйстве. – М.: Наука,1991. – 336 с.

8.        Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.А.. Активные формы кислорода и их роль в организме. - Успехи биологических наук, Т. - 1990. – с. 180 – 207.

9.        Сторожок Н.М.. Межмолекулярные взаимодействия компонентов природных липидов в процессе окисления. – Автореферат на соик. Уч. Ст. д.х.н. – Москва: Ин.-т биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН, 1996. – 50 c.

10.     Bors W., Heller W., Mishel C. et. al. Flavonoids as antioxidants: Determination of radical-scavenging efficiencies. – Methods in enzymology. – Vol. 186, 1990. – p. 343 – 355.

11.     Jovanovic S.V., Steenken S., Simic M.G. et al. Antioxidant properties of flavonoids: reduction potentials and electron transfer reactions of flavonoid radicals. - In book: Flavonoids in health and deseases. – Chapter 5, 1999. – p. 137 – 161.

12.      Porter N.D. Chemistry of lipid peroxidation. – Methods of enzymology. – Vol. 105, 1984. – p. 273 –285.

13.     Saskia A.B., E. van Acker, Aalt B. et. al. Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids. – In book: Flavonoids in health and deseases. – Chapter 9, 1999. – p. 221 – 251.