09 марта 2016г.
Современная наука все больше задается вопросом организации клеточных популяций в пространстве. Пространственно-временная организация онтогенеза – один из ключевых моментов формирования и существования такой сложнейшей системы, как многоклеточные организмы. Реализация генетических программ в развитии возможна только при усложняющихся пространственных взаимодействиях клеток. На практике мы можем создавать слои одинаковых клеток на естественных или искусственных подложках. Условия 3D-культивирования расширяют возможности формирования клеточных образований, представленных разными типами клеток. Однако, даже частично воспроизвести условия многоклеточного организма в условиях invitro пока не удается. Регенерационные модели позволяют воссоздать морфогенез структуры, в достаточной степени, приближенный к онтогенетическому развитию.
Традиционно процессы регенерации впервые описали и изучали у холоднокровных, позднее - у теплокровных. Однако, все объекты исследования имеют существенный недостаток – узнать о механизмах формирования восстанавливающейся структуры мы можем только по дискретным точкам процесса, анализируя различными методами прерванное на определенной фазе восстановление. В этой работе мы предлагаем модель восстановления системы клеток, позволяющую непосредственно invivo наблюдать за процессом, анализировать его составляющие и влиять на условия его протекания.
Известно, что закладка медуллярного гребня дает многие клеточные линии в организме, конечный путь дифференцировки которых может сильно отличаться друг от друга: клетки периферической нервной системы, глиальные клетки, одонтобласты, пигментные клетки, основные из которых синтезирующие меланин меланоциты. Меланоциты покровов холоднокровных животных – меланофоры могут не только синтезировать, но и направленно перемещать пигментные гранулы, проявляя свойства нервных клеток (антероградный и ретроградный везикулярный транспорт). К тому же они способны к митозу в дифференцированном состоянии. Несмотря на сложную организацию цитоскелета, приспособленную для миграции пигмента, меланофоры в зрелом состоянии при делении сохраняют карту перемещения пигментных гранул в дочерних клетках, что можно считать своеобразной клеточной памятью.
Меланофоры располагаются в дерме кожи. Благодаря пигменту меланину, меланофоры легко наблюдать у интактного животного. Эти клетки у амфибий не иннервированы, но имеют ярко выраженную чувствительность к специфическим гормонам меланоцитстимулирующему гормону (МСГ) и мелатонину. Под действием мелатонина, а также адреналина происходит движение пигментных гранул (меланосом) в перикариальную область (агрегация), а под действием МСГ и некоторых других гипофизарных гормонов (АКТГ, липотропина и др.) – распределение по всей клетке (дисперсия). Соотношение гормонов-регуляторов в организме и, соответственно, состояние клеток пигментной системы покровов регулируется световыми условиями. Увеличение численности пигментных клеток в процессе развития происходит как за счет митозов, так и за счет дифференцировки новых клеток из бластных форм меланобластов.
Материалы и методы. Личинок шпорцевой лягушки Xenopuslaevis содержали при постоянных условиях в термостате ТСО-1/80 СПУ при температуре 22-24oС при освещении 40 люкс. Такой уровень освещенности лежит в оптимальном интервале для проявления т.н. фоновых пигментных реакций – определенная степень дисперсии пигмента в клетках на соответствующем фоне (разности интенсивности падающего и отраженного фоном света), осуществляющая камуфлирующие адаптивные функции в организме [4]. Личинок содержали на белом, сером или черном (неотражающем) фонах. Была также сформирована группа личинок, которая содержалась в аквариуме с отражающими стенками и ярким освещением. Серый фон был определен как нейтральный, поскольку пигментные клетки личинок на этом фоне имели промежуточную степень дисперсии пигмента. Каждая группа включала более трех контрольных и опытных животных. У головастиков из экспериментальной группы разрушали пигментные клетки (меланофоры) на участке от глаза до проекции правой дуги аорты. Разрушение меланофоров на выбранном стандартном участке проводили без нарушения эпителия легким надавливанием стеклянным капилляром на кожу животного. Операцию контролировали под бинокуляром ЛОМО МСП-1. Эксперимент длился 12 дней. На 2,5,7,9 и 12 день проводили видеофиксацию стандартных участков покровов на камеру ToupCam. Проводили подсчет поделившихся меланофоров и дифференцирующихся denovo. Анализ числа клеток вели с помощью программы ImageJ и Excel. При первом подсчете подбирался определенный участок с 30 клетками. В опытную и контрольную группы были включены головастики 46-48, 52-54 и 55-58 стадий [5].
Результаты:
Показано, что по истечении срока наблюдения число пигментных клеток на анализируемом участке покровов у личинок опытной группы больше по сравнению с контрольной. Обнаружено отличие характера регенерации на разных стадиях развития: с увеличением стадии, восполнение числа клеток все более зависит от дифференцировки меланобластов, митозы встречаются все реже. После 57 стадии митозы отсутствуют, даже у личинок, содержащихся на темном фоне. Новообразованные пигментные клетки в коже головастиков опытной группы на момент окончания эксперимента меньше по размеру, чем интактные клетки в 2-3 раза по диаметру. У личинок 55-58 стадий развития, содержащихся на белом фоне, наблюдалось значительное понижение пролифератиной активности, так что в конце опыта общее число клеток в исследуемом регионе было на 30% меньше, чем до операции. Причем новообразованные клетки были меньше интактных и не восполняли нормальную пигментацию в очаге поражения.
После механического воздействия происходит не только активация меланобластов, но и инициация митозов среди популяции зрелых меланофоров. Восстановление пролиферативной активности происходило на 66 стадии, т.е. после завершения метаморфозного климакса и формирования пигментной единицы[2]. На ранних стадиях (46-48) число клеток у контрольных головастиков превышало число клеток после регенерации у животных опытной группы. Для животных, содержащихся на темном фоне опытной группы этот показатель составил – 59%, на сером фоне - 34%, на белом фоне – 17%. В то же время в контрольной группе мы наблюдали увеличение числа клеток на 74%, 71%, 44% соответственно. Для 52-53 стадии показано, что увеличение числа клеток в контрольной группе происходило на 14-21% с минимумом на белом фоне, а в опытной группе на 40-52% соответственно. На поздних стадиях развития (после 54) увеличение числа клеток наблюдалось только на сером и черном фоне (56% и 54% соответственно), на белом фоне число клеток на исследуемом участке кожи после операции было меньше, чем до нее. В контроле число клеток изменилось незначительно.
Вероятно, потеря контактного ингибирования стимулирует клетки к митозу, а воспалительная реакция к дифференцировке меланобластов. Причем на интенсивность этих процессов оказывают влияние гормоны МСГ и мелатонин, концентрация которых в организме напрямую зависит от светового режима. Отмечено, что на черном фоне личинки шпорцевой лягушки наиболее интенсивно растут на стадиях от 48 до 54. Белый фон тормозит развитие личинок на ранних стадиях, безразличен на стадиях 52-54, и ускоряет развитие на поздних стадиях. Данный эксперимент подтверждает влияние фона на пролиферативную активность недифференцированных клеток и при регенерационном морфогенезе , а значит и на общее состояние личинок.
В серии экспериментов, где животные содержались при ярком освещении на отражающем фоне. В контроле число меланофоров в покровах не увеличивалось, в опыте клетки не восполнялись, а сами личинки не развивалось в течение нескольких месяцев.
В условиях сложной биологической системы является достаточно трудоемким определить ключевой фактор, изменение которого приводит к оригинальному показателю контролируемого признака. В нашем случае стандартизированные условия содержания личинок позволяют заключить, что действие избыточного количества мелатонина тормозит процесс дифференцировки и восстановления пигментации покровов [4]. Данная реакция обусловлена одновременно физиологическим и биохимическим свойством мелатонина. Этот гормон, специфически связываясь с рецепторами на мембране меланофоров, удерживает меланосомы в области около ядра и центромеры, что мешает образованию веретена деления. Кроме того, мелатонин как универсальный антиоксидант [1] может снижать уровень активных радикалов и тем самым метаболическую активность клетки, благодаря чему многие процессы в меланобласте замедляются, тем самым откладывая дифференцировку на более поздний срок.
Список литературы
1. Беспятых А.Ю., Бурлакова О.В., Голиченков В.А., Мелатонин как антиоксидант: основные функции и свойства 2010, т130 №5 сс 487-496
2. Виноградская И.С. Молчанов А.Ю. Структурно-функциональная перестройка кожи шпорцевой лягушки в период метаморфоза, XVI Ломоносовские чтения, стр. 7
3. Захарова Л.А. Влияние световых условий на развитие меланиновой пигментации в онтогенезе амфибий: автореф. дис. ... канд. биол. наук. М.,1983. 22 с. 3.
4. Молчанов А.Ю., Точило У.А., Виноградская И.С., Супруненко Е.А., Бурлакова О.В., Голиченков В.А. Репаративные процессы в пигментной системе в период личиночного развития бесхвостых амфибий, Сложные системы, №3 (12), с. 47-62
5. Nieuwkoop P.D., Faber J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin)// Amsterdam. 1956. P. 1-243
6. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells, 2007 Nature 448, 313-317
