МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ И ОЦЕНКЕ ВОССТАНАВЛИВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ НА ОСНОВЕ N,N’-ДИФЕНИЛ-П-БЕНЗОХИНОНДИИМИНА

Аннотация.

Нами показано, что восстановительный механизм действия природных антиоксидантов является важным параллельным механизмом, альтернативным антирадикальному. Для оценки вклада восстановительного механизма природных соединений в их антиоксидантную активность нами предложена бинарная модельная редокс-система с примерно равными исходными концентрациями окисленной и восстановленной форм N,N’- дифенил-п-фенилендиамина (ДФФД). Показано, что протекание в этой системе реакций восстановления ДФФД L-аскорбиновой кислотой, L-аскорбилпальмитатом, тролоксом и кверцетином характеризуется значительным смещением равновесия к продукту восстановления ДФФД, что может служить мерой восстановительного эффекта. На основании полученных кинетических данных для указанных восстановителей предложены возможные механизмы восстановления окисленной формы ДФФД. На  основании структурной комплементарности молекул ДФБХД и кверцетина и кинетических кривых предложен одностадийный механизм двухэлектронного восстановления ДФБХД кверцетином как один из возможных маршрутов реакции.

Ключевые слова: восстановительный эффект, реакции восстановления, антирадикальная активность, антиоксидантная активность, L-аскорбиновая кислота, L-аскорбилпальмитат, тролокс, кверцетин.

Abstract. It is demonstrated that reductive mechanism of native antioxidants action may be a parallel to radical scavenge mechanism. We proposed model red-ox system including equal concentrations of reduced and oxidated (N, N’- diphenyl-p-benzoquinone DPBQ) form of N, N’-Diphenyl-p-phenylenediamine (DPPD), for the estimation of role of this mechanism in antioxidant activity of native antioxidant including L-ascorbate, L-ascorbylpalmitate, trolox and quercetin. It is estimate that this antioxidants shift equilibrium of model reaction direct to DPPD. This shift is measure of its reductive effect. It is proposed one stage two electrons mechanism of reduction of DPBQ by quercetin as a possible pathway of reaction.

Keywords: reduce effect, reduce reactions, antiradical activity, antioxidant activity, L-ascorbic acid, L- ascorbylpalmitate, trolox, quercetin.

Свободно-радикальные и перекисные процессы и обусловленный ими синдром пероксидации в организме является важным, а во многих случаях и определяющим механизмом возникновения и протекания широкого круга заболеваний, включая сердечно-сосудистые, онкологические, воспалительные, вирусные и бактериальные инфекции и многие другие заболевания и состояния [5], объединяемых понятием «свободно-радикальная патология». В связи с этим антиоксидантная профилактика и терапия таких заболеваний предполагает широкое использование антиоксидантов, в первую очередь, природных.

К сожалению, подавляющее большинство исследований антиоксидантов в основном нацелено на оценку их антиокислительной активности в выбираемых модельных условиях, и которая нередко отражает именно антирадикальную активность или способность антиоксиданта инактивировать инициируемые искусственно или уже «готовые» стабильные свободные радикалы. Нередко эти данные противоречивы, и зависят от использованной модели, природы радикалов и метода определения активности, что без учета механизма антиоксидантного действия в определенной степени их обесценивает. Поэтому не просто констатация факта проявления антирадикальной и антиоксидантной активности и даже определение ее величины, а изучение механизмов антиоксидантного действия, предполагающее строгий количественный, и, прежде всего кинетический подход, является актуальной, приобретающей все большее значение задачей.

В соответствие с современными представлениями механизмы антирадикального и антиоксидантного действия включают различные аспекты. Антиоксиданты функционируют как а) «ловушки» свободных радикалов и факторы обрыва цепей свободно-радикального окисления; б) восстановители оксидантов; в) «хелаторы» переходных металлов – факторов прооксидантного действия; г) ингибиторы ферментов прооксидантного действия и т.д. Наиболее разработанными направлениями исследований действия природных антиоксидантов, являются изучение их активности в качестве «ловушек» свободных радикалов [3], или факторов обрыва цепей свободно-радикального окисления, или «хелаторов» переходных металлов. Однако, такие известные и широко используемые в БАД природные антиоксиданты, как витамины C и E, флавоноиды и, возможно, катехины, резвератролы и другие растительные полифенольные соединения могут проявлять свою антиокислительную активность как эффективные нерадикальные химические восстановители. Т.е. они могут участвовать в процессе превращения окисленных и, одновременно, нерадикальных форм соединений (в отсутствие их начальных свободно-радикальных состояний), например, хинонов, в восстановленные. И этот аспект их действия изучен крайне недостаточно, при этом он представляется чрезвычайно важным для стабилизации и сохранности включённых, например, в рецептуры БАД и продукты быстро окисляющихся активных восстановленных форм, например, таких соединений, как восстановленная форма коэнзима Q10 – убихинол, токоферол (витамин E) и т.д.

Применяемые в лабораторной практике методики оценки восстанавливающей активности, основанные на реакциях восстановления «красной кровяной соли» гексаферрицианида калия [7] или комплекса трипиридилтриазина с ионами железа Fe3+ [6], используют водную среду, в которой практически невозможно тестировать на восстанавливающую активность гидрофобные восстановители, такие как, например, пальмитиновый эфир аскорбиновой кислоты, ряд полифенолов и восстановленных хинонов. Таким образом, несмотря на удобную длину волны поглощения (700 нм и 593 нм), использование водной среды в этих методиках ограничивает круг природных восстановителей преимущественно гидрофильными, растворимыми в воде, соединениями.

Поэтому можно полагать, что изучение восстанавливающей активности ряда природных органических соединений является перспективным именно в среде органических растворителей, способных к растворению как достаточно гидрофобных, так и гидрофильных соединений.

Нами был  обнаружен эффект  восстановления N,N'-дифенил-пара-бензохинондиимина (ДФБХД) биологически активными органическими соединениями: гидрофильной L-аскорбиновой кислотой (АК), гидрофобным L-аскорбилпальмитатом (АКП), кверцетином и тролоксом (водорастворимый аналог a-токоферола) [2]. Причем, для L-аскорбиновой кислоты и L-аскорбилпальмитата в этой системе наблюдался приоритет восстановительного эффекта над их антирадикальным эффектом.

Цель исследования. Настоящее сообщение посвящено изучению кинетики и механизмов протекания восстановительных реакций с L-аскорбиновой кислотой, L-аскорбилпальмитатом, тролоксом и кверцетином в выбранной модельной редокс-системе, и связи кинетических и термодинамических параметров реакций со структурными особенностями молекул этих соединений.

Материалы и методы. В качестве модельной выбрана бинарная редокс-система «N,N’-дифенил-п- фенилендиамин (ДФФД) - N,N’-дифенил-п-бензохинондиимин (ДФБХД)» с соотношением концентраций восстановленного и окисленного компонентов соответственно 0.82:1. В качестве реакционной среды нами предложен диметилацетамид (ДМА, ε = 37.8), обладающий высокой растворяющей способностью как в отношении гидрофобных, так и гидрофильных соединений.

Концентрационные условия проведения реакций подбирались таким образом, чтобы концентрация восстановителя (антиоксиданта) была не менее, чем в 10-кратном избытке по отношению к концентрации окисленного ДФБХД. Реакции восстановления ДФБХД проводили в стеклянных стандартных термостатируемых кюветах с ходом луча 10 мм в отсутствие инициации радикалов при температуре 25° C. О степени восстановления ДФБХД судили по изменению величины оптической плотности раствора при 450 нм - длине волны поглощения ДФБХД. Регистрацию спектров и кинетических кривых расходования ДФБХД осуществляли в автоматическом режиме на двулучевом спектрофотометре «Specord M-40».

Результаты и их обсуждение. Кинетические кривые расходования ДФБХД при его восстановлении L- аскорбиновой кислотой, тролоксом и кверцетином (Рисунок 1) отвечают кинетическому уравнению первого порядка и удовлетворительно линеаризуются в координатах ln(C-C¥) – t для обратимой реакции. Введение в модельную редокс-систему изучаемых восстановителей приводит к значительному сдвигу равновесия в сторону образования восстановленного продукта - возрастанию значения Kр (Табл.1) по сравнению с начальным значением (0.82 ± 0.06). Приведенные в Табл.1 значения констант Kр равновесия рассчитаны из отношения равновесных концентраций C¥(ДФФД)/C¥(ДФБХД) соответственно восстановленной и окисленной формы, образующихся в ходе реакции. Полученные из величины Kр и наблюдаемой константы (kred(1) + kox(1)) значения констант скоростей kred(1) прямой (восстановление) и kox(1) обратной (окисление) реакций [1] приведены в Табл.1.

Таблица 1  

Кинетические параметры восстановительной активности в редокс-системе «ДФФД – ДФБХД»

Соединение	Kр	kred(1), ´ 10-6 с-1	kox(1), ´ 10-6 с-1	kred(2), ´ 10-3 моль-1 л с-1	DG0, ккал/моль	Τ50, сек
L-Аскорбиновая	51.1 ± 14.3	17880 ± 2370	350 ± 160	9600 ± 1300	-2,319	39
кислота (АК)
L-Аскорбил-	43.2 ± 16.0	15470 ± 5300	360 ± 129	8270 ± 2190	-2,221	45
пальмитат (*)
Тролокс	21.5 ± 4.2	19.1 ± 0.18	0.09 ± 0.02	8.03 ± 0.08	-1,809	36330
(a-токоферол)						(10 ч.)
Кверцетин	13.5 ± 3.9	6.11 ± 0.57	0.50 ± 0.20	3.82 ± 0.35	-1,535	113371
						(31.5 ч.)

(*) Примечание: значения периода Τ50 полувосстановления рассчитаны, исходя из значений величины kred(1).

 

Видно, что значения kred(1) реакции восстановления для АК, АКП существенно превышают соответствующие величины для тролокса и кверцетина. Соответственно значения периода полувосстановления T50 для разных восстановителей также весьма отличаются. Рассчитанное из экспериментальных данных Kр значение стандартной свободной энергии Гиббса DG0 имеет отрицательную величину для всех соединений, что характеризует термодинамическую выгодность протекания процесса восстановления ДФБХД.

Для объяснения полученных кинетических кривых нами проведена квантово-химическая PM-3 оптимизация структур молекул изучаемых соединений. Термодинамическая выгодность процессов прямого восстановления ДФБХД аскорбиновой кислотой и аскорбилпальмитатом, молекулы которых имеют по две донорные енольные группы, подтверждается расчетными значениями величины энергии ∆E отрыва атомов водорода. Так, при последовательном двухэлектронном переносе ∆E составляет величину 14.30 ккал/моль для АК и 14.65 ккал/моль для АКП, что существенно меньше энергии отрыва двух атомов водорода от молекулы ДФФД– 43.38 ккал/моль, а выигрыш в энергии при протекании реакции составляет 29.1 – 28.7 ккал/моль.

Расчетные значения расстояний между двумя соседними электронодонорными гидроксильными группами молекул АК и АКП (3.05 Ǻ) и атомами азота (5.7 Ǻ) как акцепторными центрами молекулы хинондиимина ДФБХД существенно различаются, что исключает возможность одностадийного механизма двухэлектронного переноса.

Таблица 2 

Расчетные значения энергий переноса электрона

	ДФБХД	Аскорбиновая кислота	Аскорбил- пальмитат	Тролокс	Кверцетин
∆E,	1: 18.194	1-OH: 10.343	1-OH: 11.409	20.218	3-OH: 16.009
ккал/моль	2: 25.184	2-OH: 13.747	2-OH: 12.748		3’-OH: 21.541
					4’-OH: 16.831
Двухэлектрон-ный
перенос	43.378	14.301	14.647	-	38.064

Очевидно, что в ходе переноса электрона с молекул АК и АКП при восстановлении ДФБХД образуется некоторая концентрация радикалов АК· (или АКП·). С учетом известной способности аскорбиновой кислоты регенерироваться [4] при диспропорционировании указанных радикалов (по нашим данным, выигрыш в энергии составляет 6.39 – 13.19 ккал/моль) изучаемый процесс восстановления можно представить в виде кинетической схемы:

маловероятен по причине термодинамической невыгодности, поскольку образование из них одной восстановленной молекулы ДФФД и окисленной ДФБХД не приводит к выигрышу в энергии (затрата энергии составляет 7.0 ккал/моль).

Учитывая, что на всем изучаемом промежутке времени кинетика расходования ДФБХД при действии АК отвечает экспоненциальному закону с единой константой скорости kred(1), а одностадийный двухэлектронный перенос невозможен по причине различия в межатомных расстояниях, можно полагать, что реакция диспропорционирования радикалов АК протекает с высокой скоростью, т.е.  kd >> kred(1). В этом случае наблюдаемые кривые расходования ДФБХД отвечают лимитирующей стадии восстановления аскорбиновой кислотой, а измеренная константа kred(1) является константой скорости восстановления ДФБХД.

Для пальмитинового эфира аскорбиновой кислоты (АКП) на зависимости (Рисунок 2) имеется два участка кривой расходования ДФБХД. Все наблюдаемые кривые отвечают кинетическому уравнению:

где k1(1), k2(1) – константы скорости восстановления, а C01 , C02 – параметры уравнения, характеризующие исходные концентрации ДФБХД. Таким образом, на изучаемом интервале времени наблюдается изменение закона скорости расходования ДФБХД и механизма его восстановления.

Это можно объяснить, если предположить протекание в системе параллельной стадии, в определенный момент времени становящейся лимитирующей. И, действительно, как и в случае с АК имеет место несоответствие расчетных межатомных расстояний между электронодонорными группами АКП (3.09 Ǻ) и акцепторными группами хинонимина (5.7 Ǻ), что также указывает на невозможность одностадийного механизма двухэлектронного переноса на молекулу ДФБХД. А образующиеся в системе радикалы АКП· в силу пространственных трудностей, обусловленных длинной пальмитиновой цепью, в меньшей степени способны к диспропорционированию, что может уменьшать величину kd. В силу этого, накопление их стационарной концентрации в системе может привести к уменьшению соотношения kd / kred(1) , а реакция гашения радикалов kd стать лимитирующей стадией всего процесса. Таким образом, можно полагать, что наблюдаемая константа скорости k2(1), значения которой лежат в пределах (1.3×10-3 ¸ 7.2×10-3) с-1 суть константа гашения радикалов kd (пологий участок кривой на Рисунке 2).

Для тролокса и кверцетина на всем изучаемом интервале времени соблюден единый экспоненциальный закон скорости расходования ДФБХД, что, очевидно, может означать одностадийное восстановление до семихинониминных радикалов и последующее восстановление ДФФД. Как монофенольное соединение тролокс обладает одной электронодонорной группой, величина ∆E для которой составляет 20.22 ккал/моль, тогда как для образования семихинониминного радикала ДФФД· требуется 25.18 ккал/моль (выигрыш в энергии 4.96 ккал/моль). При полном восстановлении ДФФД общий выигрыш в энергии составляет 23.16 ккал/моль (Табл.2). Таким образом, протекание реакции восстановления ДФБХД тролоксом является термодинамически выгодным. Полученное значение константы скорости kred(2) для тролокса на 3 порядка меньше (см. Табл.1), чем для АК и АКП.

Для кверцетина как полифенольного соединения, обладающего как минимум тремя потенциально активными гидроксильными группами 3-OH, 3’-OH и 4’-OH, значения энергии ∆E электронного переноса для которых минимальны (таблица 2) и не превышают ∆E = 25.18 ккал/моль, можно предположить два возможных механизма протекания реакции. Один из них – одноэлектронный, протекающий в одну стадию восстановления до семихинониминного радикала, выигрыш в энергии которого составляет соответственно 9.18, 3.64 и 8.35 ккал/моль для 3-OH, 3’-OH и 4’-OH электронодонорных групп. При этом механизм утилизации (диспропорционирования) из системы флавоноксильных радикалов кверцетина представляется маловероятным из-за термодинамической невыгодности процесса, что должно приводить к появлению в системе новых маршрутов окисления этими радикалами и усложнению кинетики реакции. Напротив, на всем изучаемом интервале времени строго соблюден экспоненциальный закон расходования ДФБХД. Тем самым можно предполагать наличие в системе другого механизма восстановления - двухэлектронного, протекающего в одну стадию и отвечающего  кинетическому закону I порядка.     Возможно, это приводит к появлению в системе окисленного кверцетина, молекулы которого имеют хиноидоподобную структуру [2].

Отметим, что возможность протекания реакции по двухэлектронному одностадийному механизму восстановления до ДФФД обусловлена небольшим выигрышем в энергии 5.31 ккал/моль (см. Табл.2). В то же время полученные в расчетах значения межатомных расстояний между центрами 3-OH и 4’-OH электронодонорных групп молекулы кверцетина и электроноакцепторными азотистыми центрами ДФБХД близки и составляют 5.7 Ǻ и 5.4 Ǻ соответственно, что указывает на структурную комплементарность молекул кверцетина и ДФБХД, облегчающую перенос электрона (Рисунок 3).

Отметим также, что флавоноиды, сходной с кверцетином химической структуры – дигидрокверцетин, 3- OH-группа в кольце C которого является спиртовой, рутин как дигликозид кверцетина, и лютеолин, у которого она отсутствует при наличии сопряжения в C-кольце, не приводят к заметному восстановлению ДФБХД. Причины этого обусловлены структурными особенностями каждого из этих соединений, главной из которых представляется характер 3-OH группы. Так, в отличие от молекулярной структуры кверцетина с 3-OH группой для указанных соединений антиоксидантная восстановительная активность определяется только активностью 3’- и 4’-OH донорных групп кольца B [2].

Заключение.

Для оценки вклада восстановительных эффектов различных соединений антиоксидантов в антиоксидантную активность нами предложена модельная редокс-система с примерно равными исходными концентрациями окисленной и восстановленной форм ДФФД-ДФБХД. Протекание в этой системе реакций восстановления ДФБХД L-аскорбиновой кислотой, L-аскорбилпальмитатом, тролоксом и кверцетином носит обратимый характер и характеризуется значительным смещением равновесия к продукту восстановления ДФФД, что может служить мерой восстановительного эффекта. Полученные значения величины констант равновесия для указанных соединений имеют сравнимые значения, что указывает на сопоставимость восстановительных эффектов, проявляемых структурно разными соединениями. Значительные отличия (на три порядка) в величине константы kred (2) скорости реакций для АК и АКП от соответствующей величины для тролокса и кверцетина, вероятно, обусловлено как термодинамической выгодностью участия двух атомов водорода в процессе восстановления, так и высокой способностью аскорбиновой кислоты к регенерации. При этом, для молекул АКП, обладающих пространственными трудностями, стадия диспропорционирования соответствующих радикалов является скорость лимитирующей стадией, а наблюдаемая константа скорости реакции соответствует величине kd. На основании полученных  кинетических данных и структурной комплементарности молекул ДФБХД и кверцетина предложен одностадийный механизм двухэлектронного восстановления ДФБХД кверцетином как один из возможных маршрутов реакции.

Таким образом, нами показано, что восстановительный механизм действия рассматриваемых антиоксидантов является важным параллельным и альтернативным механизмом действия природных антиоксидантов, которые обычно рассматриваются как «ловушки» свободных радикалов и цепь-обрывающие факторы.

Список литературы

1.     Герасимов Я.И. Курс физической химии. Т. 1./ Герасимов Я.И. – М.: Химия, 1973. – 656 с.

2.     Дадали Ю.В. К вопросу о механизмах антиоксидантного действия природных полифенольных соединений в апротонных средах. II. Антирадикальный и восстанавливающий эффект. / Дадали Ю.В., Дадали В.А. // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. – 2004. – Вып. 2. – С. 62 - 66.

3.     Дадали Ю.В. Сравнительное кинетическое исследование антирадикальной и антиоксидантной активности природных полифенолов в реакциях инициированного окисления N,N'-дифенил-п-фенилендиамина / Дадали Ю.В., Дадали В.А., Макаров В.Г., Кулеба В.А. // Профилактическая и клиническая медицина. – 2014. – Вып. 1 (50). – С. 93 – 99.

4.     Девис, М. Витамин C. Химия и биохимия / М. Девис, Дж. Остин, Д. Патридж. – М.: Мир, 1999. – 176 с.

5.     Дадали В.А. Биохимические основы действия микрокомпонентов пищи / Шабров А.В., Дадали В.А., Макаров В.Г. – М.: 2003. – 174 с.

6.     Antonovich M., Prenzler P.D., Patsalides E. et al. Methods for testing antioxidant activity. // The Analist. - 2002. - Vol. 127. - P. 183 - 198.

7.     Dorman H.J.D., Peltoketo A., Hiltunen R. et al. Characterization of the antioxidant properties of deodorized aqueous extracts from selected Lamiaceae herbs. // Food Chemistry. - 2003. - Vol. 83. - P. 255 - 262.